JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Materials
Referências
Tadução automática
Biologia

Laser fange Microdissection af yderst rene trabekelværket fra mus øjne for gen Expression analyse

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/57576
, , , , , , ,
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

Summary

Her, beskriver vi en protokol for en reproducerbar laser fange microdissection (LCM) til isolering af trabekelværket (TM) for downstream RNA analyse. Evnen til at analysere ændringer i genekspression i TM vil hjælpe med at forstå de underliggende molekylære mekanismer af TM-okulær sygdomme.

Abstract

Laser fange microdissection (LCM) har tilladt gen expression analyse af enkelt celler og beriget cellepopulationer i væv sektioner. LCM er et fantastisk værktøj for studier af de molekylære mekanismer bag Celledifferentiering og udvikling og progression af forskellige sygdomme, herunder glaukom. Glaukom, som består af en familie af progressive optic neuropatier, er den mest almindelige årsag til uoprettelige blindhed på verdensplan. Strukturelle ændringer og skader inden for trabekelværket (TM) kan resultere i øget intraokulært tryk (IOP), som er en stor risikofaktor for at udvikle grøn stær. De præcise molekylære mekanismer involveret er dog stadig dårligt forstået. Evnen til at udføre gen expression analyse vil være afgørende for at opnå yderligere indsigt i funktionen af disse celler og dens rolle i reguleringen af IOP og glaukom udvikling. For at opnå dette, beriget en reproducerbar metode til isolering af stærkt TM fra frosne dele af mus øjne og en metode for downstream gen expression analyse, som RT-qPCR og RNA-Seq er nødvendig. Den metode beskrevet heri er udviklet for at isolere meget ren TM fra mus øjne for downstream digital PCR og microarray analyse. Derudover kan denne teknik være let tilpasses til isolation af andre højt beriget okulær celler og celle rum, der har været vanskelige at isolere fra mus øjne. Kombinationen af LCM og RNA analyser kan bidrage til en mere omfattende forståelse af de cellulære begivenheder underliggende glaukom.

Introduction

Glaukom er en gruppe af sygdomme karakteriseret ved optisk neuropati og retinopati, der i sidste ende fører til uoprettelige blindhed1,2. Skønsmæssigt vil leve med en form for sygdom3,4,5,6,7af 2020 over 70 millioner mennesker verden over. Primær åbenvinklet glaukom (POAG), den mest udbredte type af glaukom, er karakteriseret ved et fald i vandige humor (AH) udstrømning fører til øget intraokulært tryk (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Venstre ubehandlet, kronisk forhøjet IOP fører til progressiv og irreversible skader på nethinden og synsnerven hoved forårsager radial blindhed1,2,19. Alle nuværende metoder til at bremse progression af glaukom fokus på at reducere IOP, enten ved at reducere satsen for produktionen af AH af ciliare eller forbedre det udstrømning1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabekelværket (TM) spiller en afgørende rolle i aktivt regulere den primære AH udstrømning pathway og dens forkert funktion er en udløsende faktor for hypertensive glaukom1,2,19. Men de molekylære mekanismer forbundet med TM dysfunktion og hvordan det regulerer AH dræning er endnu ikke fuldt forstået og er i øjeblikket en større fokus på glaukom research1,2,19, 20. mens flere genome-wide association studier (GWAS) har knyttet en række gener til grøn stær og øget modstand mod AH udstrømning facilitet på TM, de præcise molekylære mekanismer, der fører til sygdommen ikke er endnu fuldt ud forstået21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Dyremodeller har styrket vores nuværende viden om sygdomsprogression i glaukom (grundigt gennemgået i3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Flere banebrydende metoder er blevet udviklet for at studere TM34,35,36 , og disse metoder har været meget anvendt til at fremme vores nuværende forståelse af normale og syge væv. Et område, der ikke er blevet grundigt udforsket er brugen af genetisk modificerede musemodeller at studere de molekylære mekanismer af TM fiasko. Transgene knock-i og knock-out mus undersøgelser af TM forbundet gener, som Myocilin (Myoc)37,38 og Cyp1b139, har været de primære værktøjer til at studere de molekylære mekanismer af TM funktion. Forståeligt nok, den lille størrelse af TM i mus repræsenterer en alvorlig forhindring, der skal overvindes for at begynde at studere dette væv. Musemodeller repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at undersøge genetik og molekylære mekanismer af sygdommen, mens fremskridt i LCM teknologier give de nødvendige værktøjer for at give studiet af de mindste og mest delikate væv, herunder TM.

I denne betænkning, er en robust og reproducerbar metode beskrevet for LCM af højt beriget TM fra mus øjne sammen med efterfølgende RNA isolering og forstærkning for downstream udtryk analyse. Lignende metoder har været anvendt med succes i mus for at isolere andre typer af øjet væv40,41,42,43,44, metoden rapporteret heri kan anvendes til andre diskrete væv af øjet til at studere RNA, mikroRNA, DNA og proteiner. Vigtigst, denne teknik giver mulighed for brug af genmodificerede mus til bedre at forstå de molekylære patogenese af TM værdiforringelse i glaukom og okulær sygdomme3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. Evnen til at isolere TM mus øjne af LCM vil være en nyttig teknik i at opnå yderligere indsigt i de molekylære mekanismer af flere okulær sygdomme.

Protocol

Den nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Animal Care og skik udvalg (ACUC) godkendt alle metoden i dette studie under NIEHS dyr studere forslag IIDL 05-46. 1. optimal væv indsamling til Laser Microdissection Få 2 til 3-måned-forhenværende mus, mandlige eller kvindelige C57BL/6. Aflive med CO2 for mindst 1 min eller indtil respiration er ophørt. Fjerne dyret fra buret og forsikre død af cervikal dislokation, halshugning eller torakotomi. …

Representative Results

LCM indsamlet RNA fra TM og corpus ciliare fra 4 forskellige mus blev isoleret for at kunne analysere genekspression og sammenligne udtryk med det i hele øjet, sclera, iris, nethinden, hornhinden og linsen isoleret fra tre separate mus. TM giver udtryk for gener, blev MYOC48 og ACTA249 analyseret i alt indsamlet væv til at bekræfte, at de isolerede TM prøver var stærkt beriget i TM. På grund af den ekstremt lave mæng…

Discussion

TM spiller en afgørende rolle i aktivt opretholde homeostatiske IOP og dens dysfunktion er bredt accepteret som den vigtigste udløsende faktor for hypertensive glaukom1,2,19. En række enkelt nucleotid polymorfier i flere gener identificeret ved GWAS analyse har været knyttet til øget glaukom risiko og øget modstand mod AH udstrømning facilitet på TM; de præcise molekylære mekanismer, der giver anledning til denne sygdo…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Tags

Laser MicrodissectionTrabecular MeshworkGene Expression AnalysisOcular DiseasesRNA IsolationCryostat SectioningH&E StainingLaser Capture Microscopy
check_url/pt/57576?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image