Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour une microdissection laser reproductible de la saisie (LCM) pour isoler le réseau trabéculaire (TM) pour l’analyse en aval de RNA. La capacité d’analyser les changements dans l’expression des gènes dans le TM aidera à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents des maladies oculaires liées au TM.
Abstract
Microdissection de saisie de laser (LCM) a permis à analyse d’expression de gène des cellules individuelles et enrichi des populations de cellules dans des sections de tissu. LCM est un excellent outil pour l’étude des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation cellulaire et le développement et la progression de diverses maladies, notamment un glaucome. Le glaucome, qui comprend une famille de neuropathies optiques progressifs, est la cause la plus fréquente de cécité irréversible dans le monde entier. Augmenté la pression intraoculaire (PIO), qui est un facteur de risque majeur pour le développement de glaucome peuvent entraîner des changements structurels et des dommages dans le réseau trabéculaire (TM). Cependant, les mécanismes moléculaires précis sont encore mal compris. La capacité d’effectuer l’analyse de l’expression génique sera cruciale pour obtenir un complément d’éclairage sur la fonction de ces cellules et son rôle dans la régulation du développement IOP et glaucome. Pour ce faire, une méthode reproductible pour isoler fortement enrichi TM de coupes congelées d’yeux de souris et une méthode pour l’analyse de l’expression génique en aval, tels que la RT-qPCR et RNA-Seq est nécessaire. La méthode décrite ici est développée pour isoler fortement pur TM des yeux de souris pour PCR numérique en aval et l’analyse de microarray. En outre, cette technique peut être facilement adaptée pour l’isolement des autres cellules oculaires hautement enrichis et les compartiments cellulaires qui ont été difficiles à isoler des yeux de souris. La combinaison de l’analyse de LCM et de l’ARN peut contribuer à une compréhension plus approfondie des événements cellulaires qui sous-tendent le glaucome.
Introduction
Le glaucome est un groupe de maladies caractérisées par une neuropathie optique et rétinopathie qui conduit finalement à une cécité irréversible1,2. On estime qu’en 2020 plus 70 millions de personnes dans le monde vivra avec une certaine forme de la maladie3,4,5,6,7. Glaucome primaire à angle ouvert (GPAO), le plus répandu type de glaucome, se caractérise par une diminution de l’écoulement de l’humeur aqueuse (AH) conduisant à une augmentation de la pression intraoculaire (PIO)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Gauche IOP non traitée, chroniquement élevé entraîne des dommages progressifs et irréversibles de la rétine et de la tête du nerf optique entraînant la cécité radial1,2,19. Toutes les méthodes actuelles pour ralentir la progression du glaucome portera essentiellement sur réduction IOP, soit en diminuant le taux de production de AH par le corps ciliaire ou en améliorant son écoulement1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. le réseau trabéculaire (TM) joue un rôle essentiel dans la régulation active de la voie de sortie primaire AH et sa fonction incorrecte est un facteur de causalité pour les hypertendus glaucome1,2,19. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à la dysfonction TM et comment il régule AH drainage ne sont pas encore bien compris et est actuellement une préoccupation majeure de glaucome recherche1,2,19, 20. bien que plusieurs études d’association pangénomique (GWAS) ont lié à un certain nombre de gènes au glaucome et une résistance accrue à la facilité de sortie AH à la TM, les mécanismes moléculaires exacts qui mènent à la maladie ne sont pas encore pleinement compris21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Des modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances actuelles de la progression de la maladie dans le glaucome (largement revu dans3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,,33). Plusieurs méthodes pionnières ont été développées pour étudier les TM34,35,36 , et ces méthodes ont été largement utilisées pour faire progresser notre compréhension actuelle des tissus normaux et malades. Un domaine qui n’a pas été intensivement exploré est l’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées afin d’étudier les mécanismes moléculaires de l’échec de TM. Transgénique knock-in et études sur les souris knock out de gènes TM associé, tels que Myocilin (Myoc)37,38 et39de Cyp1b1, ont été les principaux outils pour étudier les mécanismes moléculaires du TM fonction. Naturellement, la petite taille du TM chez la souris représente un obstacle sérieux qui doit être surmonté afin de commencer à étudier ce tissu. Modèles de souris représentent un outil puissant pour l’étude de la génétique et les mécanismes moléculaires de la maladie, tandis que les percées dans les technologies LCM fournissent les outils nécessaires pour permettre l’étude des tissus plus petits et plus délicats, y compris le TM.
Dans ce rapport, une méthode fiable et reproductible est décrite pour le ppcm de TM fortement enrichi d’yeux de souris avec les ARN et amplification pour l’analyse de l’expression en aval. Des méthodes similaires ont été utilisés avec succès chez des souris pour isoler des autres types d’oculaires tissus40,41,42,43,44, la méthodologie rapportée ici peut être appliquée à d’autres tissus discrètes de le œil pour étudier les ARN, micro-ARN, ADN et protéines. Ce qui est important, cette technique permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mieux comprendre la pathogenèse moléculaire de la déficience de TM dans le glaucome et maladie oculaire3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La capacité d’isoler le TM des yeux de souris par LCM sera une technique utile à obtenir un complément d’éclairage sur les mécanismes moléculaires de plusieurs maladies oculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le TM joue un rôle essentiel pour maintenir activement IOP homéostatique et son dysfonctionnement est largement reconnue comme le principal facteur causal pour hypertendus glaucome1,2,19. Un certain nombre de polymorphismes dans plusieurs gènes identifiés par analyse GWAS ont été lié à risque de glaucome accrue et une résistance accrue à la facilité de sortie AH à la TM ; Cependant, les mécanismes moléculaires pr?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
Referências
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
- Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
- . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
- . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
- . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
- Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
- Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
- Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
- Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
- Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
- John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
- Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
- Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
- Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
- Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
- Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
- Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
- Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
- Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
- Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
- Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
- Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
- Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
- Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
- Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
- Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
- Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
- Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
- Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
- Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
- Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
- Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
- Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
- Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
- Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
