Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per una microdissezione laser riproducibile (LCM) per isolare il trabecolato (TM) per analisi di RNA a valle. La capacità di analizzare i cambiamenti nell’espressione genica nella TM vi aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari delle malattie oculari correlate a TM.
Abstract
Microdissezione laser (LCM) ha consentito di analisi dell’espressione genica di cellule singole e arricchita di popolazioni cellulari in sezioni di tessuto. LCM è un ottimo strumento per lo studio dei meccanismi molecolari alla base della differenziazione delle cellule e lo sviluppo e la progressione di varie malattie, compreso il glaucoma. Glaucoma, che comprende una famiglia di neuropatie ottiche progressive, è la più comune causa di cecità irreversibile in tutto il mondo. Cambiamenti strutturali e danno all’interno il trabecolato (TM) può causare aumento della pressione intraoculare (IOP), che è un fattore di rischio importante per lo sviluppo di glaucoma. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari coinvolti sono capiti ancora male. La possibilità di eseguire analisi di espressione genica sarà cruciale per ottenere ulteriori approfondimenti la funzione di queste cellule e il suo ruolo nella regolazione dello sviluppo dello IOP ed il glaucoma. Per raggiungere questo obiettivo, un metodo riproducibile per isolare altamente arricchito TM da sezioni congelate del mouse occhi e un metodo per l’analisi dell’espressione genica a valle, come RT-qPCR e RNA-Seq è necessario. Il metodo descritto nel presente documento è stato sviluppato per isolare altamente puro TM dagli occhi del mouse per PCR digitale a valle e l’analisi di microarray. Inoltre, questa tecnica può essere facilmente adattata per l’isolamento di altre cellule oculari altamente arricchite e compartimenti cellulari che sono stati difficili da isolare dagli occhi del mouse. La combinazione di analisi LCM e RNA può contribuire a una comprensione più completa degli eventi cellulari alla base di glaucoma.
Introduction
Il glaucoma è un gruppo di malattie caratterizzate da neuropatia ottica e retinopatia che infine conduce a cecità irreversibile1,2. Si stima che entro il 2020 oltre 70 milioni di persone in tutto il mondo vivrà con qualche forma di malattia3,4,5,6,7. Glaucoma ad angolo aperto primario (POAG), il più diffuso tipo di glaucoma, è caratterizzato da una diminuzione nel deflusso di umore acqueo (AH) che conduce all’aumento della pressione intraoculare (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Sinistro non trattati, cronicamente elevato IOP conduce alla progressiva e irreversibile danno alla retina ed al nervo ottico testa causando cecità radiale1,2,19. Tutti i metodi attuali per rallentare la progressione della messa a fuoco di glaucoma sulla riduzione della IOP, diminuendo il tasso di produzione di AH di corpo ciliare o migliorare il suo deflusso1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. il trabecolato (TM) svolge un ruolo fondamentale nel regolare attivamente la via di uscita AH primaria e la sua funzione impropria è un fattore scatenante per ipertesi glaucoma1,2,19. Tuttavia, i meccanismi molecolari associati a disfunzione TM e come regola AH drenaggio ancora completamente non sono capiti ed sono attualmente degli obiettivi principali di glaucoma ricerca1,2,19, 20. mentre diversi studi di associazione genome-wide (GWAS) hanno collegato un numero di geni per il glaucoma e la resistenza aumentata alla funzione di uscita AH presso il TM, l’esatto meccanismo molecolare che portano alla malattia non sono ancora pienamente compreso21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Modelli animali hanno notevolmente migliorato la nostra conoscenza attuale di progressione di malattia nel glaucoma (esaminata estesamente in3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Sono stati sviluppati diversi metodi all’avanguardia per studiare le TM34,35,36 e questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per far avanzare la nostra comprensione corrente del tessuto normale e malato. Un settore che non è stato ampiamente esplorato è l’utilizzo di modelli di topi geneticamente modificati per lo studio dei meccanismi molecolari del fallimento di TM. Transgenici knock-in e gli studi di topo knock-out di geni TM connesso, come Myocilin (Myoc)37,38 e Cyp1b139, sono stati i principali strumenti per lo studio dei meccanismi molecolari di TM funzione. Comprensibilmente, le piccole dimensioni del TM in topi rappresentano un grave ostacolo che deve essere superato per cominciare a studiare questo tessuto. Modelli murini rappresentano un potente strumento per lo studio della genetica e i meccanismi molecolari della malattia, mentre i progressi nelle tecnologie di LCM offrono gli strumenti necessari per potenziare lo studio dei tessuti più piccoli e più delicati, tra cui il TM.
In questo rapporto, un metodo affidabile e riproducibile è descritto per il LCM di TM altamente arricchito dagli occhi del mouse insieme successivo isolamento del RNA e l’amplificazione per analisi di espressione a valle. Metodi simili sono stati utilizzati con successo nei topi per isolare altri tipi di occhio tessuti40,41,42,43,44, la metodologia segnalata qui può essere applicata ad altri discreti tessuti dell’occhio per studiare il RNA, i microRNA, DNA e proteine. Soprattutto, questa tecnica consente l’uso di topi geneticamente modificati per meglio comprendere la patogenesi molecolare della compromissione TM glaucoma e malattia oculare3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La possibilità di isolare la TM degli occhi del mouse di LCM sarà una tecnica utile ad ottenere ulteriori comprensioni nei meccanismi molecolari di parecchie malattie oculari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il TM svolge un ruolo vitale nel mantenere attivamente omeostatico IOP e sua disfunzione è ampiamente accettata come il principale fattore causativo per ipertesi glaucoma1,2,19. Un numero di polimorfismi a singolo nucleotide in diversi geni identificati dall’analisi di GWAS è stato collegato al rischio del glaucoma aumentato e la resistenza aumentata alla funzione di uscita AH presso il TM; Tuttavia, i meccanismi molecolari pr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
Referências
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