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Biologia

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/57576
, , , , , , ,
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo para um laser reprodutíveis captura microdissection (LCM) para isolar a malha trabecular (TM) para a análise de RNA a jusante. A capacidade de analisar as alterações na expressão gênica na TM vai ajudar na compreensão do mecanismo molecular subjacente de doenças oculares relacionadas ao TM.

Abstract

Laser captura microdissection (LCM) tem permitido a análise da expressão de genes de células únicas e enriquecido populações de células em cortes de tecido. LCM é uma ótima ferramenta para o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes a diferenciação celular e o desenvolvimento e a progressão de várias doenças, incluindo o glaucoma. Glaucoma, que compreende uma família de neuropatia óptica progressiva, é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo. Mudanças estruturais e danos dentro da malha trabecular (TM) podem resultar em aumento da pressão intra-ocular (Pio), que é um importante fator de risco para o desenvolvimento de glaucoma. No entanto, os mecanismos moleculares precisos envolvidos são ainda mal compreendidos. A capacidade de realizar análise de expressão do gene será crucial na obtenção de mais insights sobre a função dessas células e seu papel na regulação do desenvolvimento IOP e glaucoma. Para conseguir isso, um método reprodutível para isolar altamente enriquecido TM de seções congeladas do olhos de rato e um método para análise de expressão do gene a jusante, tais como RT-qPCR e RNA-Seq é necessária. O método descrito neste documento é desenvolvido para isolar altamente pura TM de olhos de rato para a jusante do PCR digital e análise de microarray. Além disso, esta técnica pode ser facilmente adaptada para o isolamento de outras células oculares altamente enriquecidas e compartimentos de célula que tem sido difícil isolar-se dos olhos de rato. A combinação da análise de LCM e RNA pode contribuir para uma compreensão mais abrangente dos eventos celulares subjacentes glaucoma.

Introduction

Glaucoma é um grupo de doenças caracterizadas por neuropatia óptica e retinopatia que aprimorem a cegueira irreversível1,2. Estima-se que por 2020 over 70 milhões de pessoas no mundo inteiro estaremos vivendo com alguma forma de doença3,4,5,6,7. Glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), o tipo mais prevalente de glaucoma, é caracterizada por uma diminuição no escoamento do humor aquoso (AH) levando ao aumento da pressão intra-ocular (Pio)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Esquerda não tratada, cronicamente elevada IOP conduz ao dano progressivo e irreversível à retina e cabeça do nervo óptico causando cegueira radial1,2,19. Todos os métodos atuais para retardar a progressão do glaucoma enfocam reduzindo IOP, diminuindo a taxa de produção de AH pelo corpo ciliar ou aumentando a vazão1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. a malha trabecular (TM) desempenha um papel vital na regulação ativamente o caminho de saída primário AH e sua função inadequada é um fator causal para hipertensos glaucoma1,2,19. No entanto, os mecanismos moleculares associados com disfunção TM e como regula AH drenagem não são compreendidos ainda inteiramente e é atualmente um grande foco de glaucoma pesquisa1,2,19, 20. enquanto vários estudos de associação de genoma-larga (GWAS) têm associados um número de genes para glaucoma e aumento da resistência à facilidade de escoamento AH no TM, os mecanismos moleculares exatos que levam à doença não são ainda totalmente compreendidos21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Modelos animais melhoraram grandemente nosso conhecimento atual de progressão da doença no glaucoma (extensivamente revisado em3,15,16,26,,27,28, 29,30,31,32,33). Vários métodos pioneiros foram desenvolvidos para estudar o TM34,35,36 e esses métodos têm sido amplamente utilizados para fazer avançar a nossa compreensão atual do tecido normal e doente. Uma área que não tem sido extensivamente explorada é a utilização de modelos de rato geneticamente modificado para estudar os mecanismos moleculares da falha de TM. Transgênico bater-no e estudos de mata-mata rato de genes TM associado, tais como Myocilin (Myoc)37,38 e Cyp1b139, têm sido as principais ferramentas para estudar os mecanismos moleculares de TM função. Compreensivelmente, o pequeno tamanho da TM em camundongos representa um sério obstáculo que deve ser superado a fim de começar a estudar este tecido. Modelos de mouse representam uma poderosa ferramenta para estudar a genética e os mecanismos moleculares da doença, enquanto os avanços em tecnologias de LCM fornecem as ferramentas necessárias para capacitar o estudo dos tecidos menores e mais delicados, incluindo o TM.

Neste relatório, um método robusto e reprodutível é descrito para o LCM de TM altamente enriquecido de olhos de rato junto com posterior isolamento do RNA e amplificação para análise de expressão a jusante. Métodos semelhantes têm sido utilizados com sucesso em ratos para isolar outros tipos de olho tecidos40,41,42,,43,44, a metodologia aqui indicada pode ser aplicada a outros discretos tecidos do olho para estudar microRNA, RNA, DNA e proteínas. Importante, esta técnica permite o uso de camundongos geneticamente modificados para melhor compreender a patogênese molecular da imparidade TM em glaucoma e doença ocular3,15,16,17 ,18,26,31,,45,46. A capacidade de isolar o TM de olhos de rato por LCM será uma técnica útil na obtenção de mais insights sobre os mecanismos moleculares de diversas doenças oculares.

Protocol

O cuidado do Animal nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e Comité de uso (ACUC) aprovaram todos metodologia deste estudo sob o NIEHS Animal estudar proposta IIDL 05-46. 1. coleção tecido ideal para o Laser Microdissection Obter 2 a 3 meses, ratos, masculino ou feminino C57BL/6. Eutanásia com CO2 por um período mínimo de 1 min ou até respiração cessou. Retire o animal da gaiola e assegurar a morte por deslocamento cervical, decapitação ou t…

Representative Results

LCM coletados RNA de TM e corpo ciliar de 4 diferentes ratos foi isolado para ser capaz de analisar a expressão gênica e comparar a expressão com que em todo olho, esclera, íris, retina, córnea e lente isolados de três ratos separados. TM expressando genes, MYOC48 e ACTA249 foram analisados em todos os tecidos coletados para confirmar que as amostras isoladas de TM foram de fato altamente enriquecidas em TM. Devido a …

Discussion

O TM desempenha um papel vital em manter ativamente IOP homeostático e sua disfunção é amplamente aceito como o principal fator causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Um número de polimorfismos de nucleotídeo único em vários genes identificados pela análise GWAS tem sido associado ao risco aumentado de glaucoma e aumento da resistência à facilidade de escoamento AH no TM; no entanto, os mecanismos moleculares preciso…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668
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Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).
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