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Biologia

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/57576
, , , , , , ,
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

Summary

Aquí, describimos un protocolo para un microdissection de la captura del laser reproducible (LCM) para aislar la red trabecular (TM) para posteriores análisis de ARN. La capacidad de analizar los cambios en la expresión génica en el TM ayudarán en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedades oculares relacionadas con la TM.

Abstract

Microdissection de la captura del laser (LCM) ha permitido el análisis de expresión génica de las células y enriquecido las poblaciones de la célula en secciones del tejido. LCM es una gran herramienta para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes de la diferenciación celular y el desarrollo y progresión de varias enfermedades, incluyendo el glaucoma. El glaucoma, que comprende una familia de neuropatías ópticas progresivas, es la causa más común de ceguera irreversible en todo el mundo. Cambios estructurales y daños en la malla trabecular (TM) pueden resultar en aumento presión intraocular (PIO), que es un factor de riesgo para desarrollar glaucoma. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos involucrados son todavía poco conocidos. La capacidad para realizar análisis de expresión génica será crucial en la obtención de más conocimientos sobre la función de estas células y su papel en la regulación del desarrollo IOP y glaucoma. Para lograr esto, un método reproducible para aislar altamente enriquecido TM de secciones congeladas de ojos de ratón y un método para el análisis de la expresión del gen aguas abajo, tales como RT-qPCR y RNA-Seq es necesario. El método descrito en el presente documento es desarrollado para aislar TM muy puro de ojos de ratón para posterior PCR digital y análisis de microarrays. Además, esta técnica puede adaptarse fácilmente para el aislamiento de las células oculares muy enriquecidas y compartimentos celulares que han sido difíciles de aislar de ojos de ratón. La combinación de análisis LCM y el ARN puede contribuir a una comprensión más completa de los eventos celulares subyacentes glaucoma.

Introduction

El glaucoma es un grupo de enfermedades caracterizado por neuropatía óptica y retinopatía que en última instancia conduce a la ceguera irreversible1,2. Se estima que para 2020 más 70 millones de personas en todo el mundo estarán viviendo con algún tipo de enfermedad3,4,5,6,7. Glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA), el tipo más frecuente de glaucoma, se caracteriza por una disminución en la salida de humor acuoso (AH) conduce a aumento de la presión intraocular (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Pio sin tratamiento, crónicamente elevada izquierda conduce a daño progresivo e irreversible de la retina y cabeza del nervio óptico causando ceguera radial1,2,19. Todos los métodos actuales para frenar la progresión del foco de glaucoma en la reducción de Pio, ya sea por disminución de la tasa de producción de AH por el cuerpo ciliar o mejorando su salida1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la malla trabecular (TM) juega un papel vital en la regulación activa de la principal vía de salida AH y su función inadecuada es un factor causativo para hipertensos glaucoma1,2,19. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con la disfunción TM y cómo regula AH drenaje no se entienden todavía completamente y es actualmente un foco importante de glaucoma investigación1,2,19, 20. aunque varios estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) han vinculado un número de genes para glaucoma y mayor resistencia a la instalación de la salida AH en el TM, los mecanismos moleculares exactos que conducen a la enfermedad no entienden todavía completamente21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Modelos animales han mejorado considerablemente nuestros conocimientos actuales de progresión de la enfermedad de glaucoma (examinado exhaustivamente en3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Se han desarrollado varios métodos pioneros para estudiar el TM34,35,36 y estos métodos se han utilizado ampliamente para avanzar en nuestra comprensión actual del tejido normal y enfermo. Un área que no ha sido explorado extensivamente es el uso de modelos de ratón modificados genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares de la insuficiencia de TM. Transgénico knock-in y los estudios con ratones knock-out de genes TM asociado, tales como Myocilin (Myoc)37,38 y39de la Cyp1b1, han sido las herramientas principales para el estudio de los mecanismos moleculares de TM función. Lógicamente, el tamaño pequeño de la TM en ratones representa un serio obstáculo que debe superar para comenzar a estudiar este tejido. Modelos de ratón representan una poderosa herramienta para el estudio de la genética y mecanismos moleculares de la enfermedad, mientras que los avances en las tecnologías de LCM proporcionan las herramientas necesarias para potenciar el estudio de los tejidos más pequeños y más delicados, como el TM.

En este informe, se describe un método reproducible y robusto para el LCM de TM altamente enriquecido de ojos de ratón y posterior aislamiento de RNA, amplificación para análisis de aguas abajo de la expresión. Métodos similares han sido utilizados con éxito en ratones para aislar otros tipos de ojos tejidos40,41,42,43,44, la metodología que se divulga adjunto puede aplicarse a otros tejidos discretos del ojo para el estudio de RNA, microRNA, ADN y proteínas. Lo importante, esta técnica permite el uso de ratones modificados genéticamente para entender mejor la patogenia molecular de la deficiencia de la TM en glaucoma y enfermedad ocular3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La capacidad de aislar la TM de ojos de ratón por LCM será una técnica útil en la obtención de más conocimientos sobre los mecanismos moleculares de varias enfermedades oculares.

Protocol

Toda metodología de este estudio en el NIEHS Animal estudio propuesta IIDL 05-46 aprobó el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) Animal cuidado y uso de Comité (ACUC). 1. colección de tejido óptima para Microdisección láser Obtener 2 a 3 meses ratones, C57BL/6 macho o hembra. Eutanasia con CO2 para un mínimo de 1 minuto o hasta que la respiración ha cesado. Quitar el animal de la jaula y asegurar la muerte por dislocación cervical, decapitaci?…

Representative Results

LCM recogió RNA de la TM y del cuerpo ciliar de 4 ratones diferentes fue aislado para poder analizar la expresión génica y comparar la expresión con en todo ojo, esclerótica, iris, retina, córnea y lentes aisladas de tres ratones separados. TM expresando genes MYOC48 ACTA249 analizaron y en todos los tejidos recogidos para confirmar que las muestras aisladas de TM eran de hecho altamente enriquecidas en TM. Debido a l…

Discussion

El TM desempeña un papel vital en mantener activamente IOP homeostático y su disfunción es ampliamente aceptado como el principal factor causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Un número de polimorfismos de nucleótido único en genes varios identificados por análisis GWAS se han relacionado con riesgo de glaucoma aumento y aumento de la resistencia al centro de la salida AH en el TM; sin embargo, los mecanismos moleculares…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668
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Referências

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Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).
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