التحليل الجزيئي غشائي الوسيطة الانتقالية الناجمة عن تحويل الإشارات عامل النمو-β
Summary
ويرد وصف بروتوكول لتحريض في المختبر الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت)، ومفيدة للتحقيق في مسارات الإشارات الخلوية المشتركة في اندمت،. في هذا النموذج التجريبي، هو اندمت الناجمة عن المعاملة مع TGF-β في خلايا بطانية 1 مللي ثانية.
Abstract
اللدونة المظهرية من خلايا بطانية يكمن وراء تطوير نظام القلب والأوعية الدموية، وأمراض القلب والأوعية الدموية، ومختلف الشروط المرتبطة بالتليف الجهاز. في ظل هذه الظروف، يكتسب خلايا بطانية المتباينة تعمل الوسيطة مثل. هذه العملية يسمى الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت) ويتسم ب downregulation علامات بطانية، upregulation من علامات الوسيطة، والتغييرات الشكلية. اندمت هو الناجمة عن مسارات إشارات عدة، بما في ذلك تحويل عامل النمو (TGF)-β، Wnt، والدرجة، وينظمها الجزيئية آليات مماثلة لتلك التي الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT) هام ل gastrulation، تليف الأنسجة، و سرطان خبيث. فهم آليات اندمت مهم لوضع نهج التشخيصية والعلاجية التي تستهدف اندمت. تحريض قوي اندمت في المختبر مفيد لتميز التوقيعات تعبير الجينات المشتركة، وتحديد الآليات الجزيئية دروجابل وشاشة المغيرون اندمت. وهنا يصف لنا أسلوب في المختبر لتحريض اندمت. خلايا بطانية microvascular البنكرياس الماوس MS-1 الخضوع اندمت بعد التعرض لفترة طويلة إلى TGF-β وإظهار upregulation من علامات الوسيطة والتغييرات الشكلية وكذلك تحريض السيتوكينات والمستقطبات التهابات متعددة. أساليب لتحليل ميكرورنا (ميرنا) التحوير مدرجة أيضا. هذه الأساليب توفير منبر للتحقيق في الآليات الكامنة وراء اندمت والمساهمة من ميرناس إلى اندمت.
Introduction
الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت) هو العملية التي يخضع خلية غشائي متمايزة مجموعة متنوعة من التغيرات الجزيئية، الناتج في خلية مثل تنتجها الخلايا الليفية الوسيطة1. ووصفت اندمت في البداية تحول خلايا غشائي أثناء التطوير من قلب2،3. في قلب التنمية المبكرة، يتألف أنبوب القلب البطانة داخلية وعضلة القلب خارجي. يتم فصل هذه الطبقتين طبقة من المصفوفة خارج الخلية تسمى هلام القلب. الخلايا الجنينية للوفلر، التي تكتسب علامات خلية بطانية، العبور إلى الخلايا الوسيطة وتغزو هلام القلب الكامنة، وتشجيع تشكيل الوسائد القلب، توفر الأساس للصمامات بي وحاجز والصمامات سيميلونار. وعلاوة على ذلك، قد اقترح اندمت لتكون مصادر بيريسيتيس وخلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية في نظم الأوعية الدموية الجنينية الأخرى بما في ذلك الأوعية التاجية والشريان الاورطي البطني والشريان الرئوي4،،من56. وبالإضافة إلى ذلك، هو تورط اندمت في الأوعية الفسيولوجية التي تنتشر في7.
تتراكم الأدلة قد اقترح أن اندمت تشارك أيضا في العديد من أمراض القلب والأوعية الدموية وغيرها من الأمراض81،. وتشمل الشروط المرتبطة اندمت تكلس الأوعية الدموية، تصلب الشرايين، وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي، وتشوه الكهفي، تليف الجهاز، يعيد البناء الابتزاز المنوال، الخلل في allograft في زرع الكلي والسرطان8، 9،10،11،،من1213،،من1415،16،17، 18-وصف تقرير صدر مؤخرا أن عدة علامات اندمت الجزيئية يمكن أن تكون أداة للتنبؤ التشخيص والتكهن بالخلل الوظيفي الكلوي الاختلاس في زرع الكلي17. تعديل مسارات الإشارات الخلوية المتصلة اندمت قد ثبت أن تحسين ظروف المرض عدة بما في ذلك تليف القلب ويعيد البناء الابتزاز المنوال في الحيوان النماذج8،15. ولذلك فهم الآليات الكامنة وراء اندمت هامة لتطوير استراتيجيات تشخيصية وعلاجية تستهدف اندمت.
اندمت تتسم بفقدان تقاطعات خلية خلية، والزيادة في إمكانيات الهجرة، downregulation الجينات غشائي محددة مثل هاء-كادهيرين، و upregulation من الجينات الوسيطة بما في ذلك العضلات الملساء α أكتين (α-SMA). وباﻹضافة إلى ذلك، اندمت والانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT)، عملية مماثلة تقوم بتحويل الخلايا الظهارية للخلايا الوسيطة، المرتبطة بالإنتاج المتغيرة لمختلف عناصر المصفوفة خارج الخلية، التي قد تسهم في تطوير أنسجة التليف8،19.
في الآونة الأخيرة، عدة دراسات في المختبر من اندمت قد شرحت تفاصيل الآليات الجزيئية اندمت15،20. اندمت هو الناجمة عن مسارات الإشارات المختلفة بما في ذلك تحويل عامل النمو (TGF)-β، Wnt، وتحقيقها1. فيما بينها، TGF-β يلعب دور محوري في استحثاث EMT واندمت. في اندمت، لفترات طويلة التعرض لنتائج TGF-β في اندمت في خلايا بطانية شتى، في حين يبدو أن التعرض القصير غير كافية21. ونحن هنا وصف بروتوكولا مباشرة لتحريض اندمت، في أي ميل سفين 1 (MS-1) الخضوع للماوس البنكرياس خلايا بطانية microvascular اندمت في المختبر بعد التعرض لفترة طويلة إلى TGF-β20. في هذا النموذج، يمكن إجراء تحليلات متعددة للمتلقين للمعلومات للتحقيق في ملامح مميزة اندمت، بما في ذلك التغييرات الشكلية، downregulation علامات بطانية، upregulation من علامات الوسيطة والجينات التحريضية، سيتوسكيليتال ترتيبات جديدة، وانكماش جل الكولاجين.
ميكرورناس (ميرناس) هي ~ 22 nt الكشف التنظيمية الصغيرة أن المباشرة القمع بوسترانسكريبشونال مختلف مرناً الأهداف22،23. من خلال الاعتراف بالهدف تسلسل بوساطة البذور، ميرناس قمع مئات جينات المستهدفة وتعدل الوظائف الخلوية المتنوعة مثل تمايز الخلايا وانتشارها، وحركية. وهذا هو الحال لتنظيم EMT واندمت أيضا، وأبلغ ميرناس عدة المنظمين من24،EMT واندمت25. يمكن الجمع بين نموذج اندمت قدم في هذا الاستعراض بسهولة مع ميرنا تعديل إجراءات لاختبار أدوار ميرناس في اندمت. هذا الاستعراض يلخص لدينا إجراءات تجريبية للتحقيق اندمت TGF-β-المستحث في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 ويشمل أيضا مقارنة شروط الاستقراء اندمت طريق TGF-β في خلايا بطانية أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأفيد أن المنشط علاج TGF-β ورأس ح 24 الناجم عن اندمت في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1، في حين فشل TGF-β وحدها لحمل اندمت في هذه الفترة القصيرة21. دأبت، لاحظنا أن TGF-β إلى حد كبير التي يسببها اندمت بعد العلاج الطويل (ح 48 – 72) في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 خلايا20. اندمت ل?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر بوروك زيا ومييازونو كوهية للاقتراحات في إعداد مخطوطة. H.I.S. ومحمد تدعمها “زمالة أبحاث مؤسسة النصب التذكاري أوهارا”، ويدعمه H.I.S. “أوسامو هايايشى التذكاري المنح الدراسية” “الدراسة في الخارج”. وأيد هذا العمل بمنحه من مؤسسة العلوم وتاكيدا (أ. س.).
Materials
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
Referências
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Biologia do Desenvolvimento. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Pesquisa do Câncer. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs–the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Pesquisa do Câncer. 75 (7), 1244-1254 (2015).
