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Biologia

Endothelial-mesenchymal संक्रमण के आणविक विश्लेषण विकास कारक बदलने से प्रेरित-β संकेतन

Published: August 03, 2018
doi:
10.3791/57577
, , ,
1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research,Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine,University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo

Summary

इन विट्रो में endothelial-mesenchymal संक्रमण (EndMT), जो सेलुलर संकेतन EndMT में शामिल रास्ते की जांच के लिए उपयोगी है की प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । इस प्रयोगात्मक मॉडल में, EndMT एमएस-1 endothelial कोशिकाओं में TGF-β के साथ उपचार द्वारा प्रेरित है ।

Abstract

endothelial कोशिकाओं की Phenotypic प्लास्टिक हृदय प्रणाली के विकास, हृदय रोगों, और अंग फाइब्रोसिस के साथ जुड़े विभिन्न स्थितियों में निहित है । इन स्थितियों में, विभेदित endothelial कोशिकाओं mesenchymal-तरह phenotypes का अधिग्रहण । इस प्रक्रिया को endothelial कहा जाता है-mesenchymal संक्रमण (EndMT) और endothelial मार्करों के downregulation की विशेषता है, mesenchymal मार्करों के ऊपर, और रूपात्मक परिवर्तन । EndMT विकास कारक (TGF) को बदलने सहित कई संकेत रास्ते से प्रेरित है-β, Wnt, और पायदान, और EMT, ऊतक फाइब्रोसिस के लिए महत्वपूर्ण उपकला-mesenchymal संक्रमण (gastrulation) के उन लोगों के लिए इसी तरह के आणविक तंत्र द्वारा विनियमित, और कर्क मेटास्टेसिस । EndMT के तंत्र को समझना नैदानिक और चिकित्सकीय EndMT लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इन विट्रो में EndMT की मजबूत प्रेरण आम जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर की विशेषता के लिए उपयोगी है, druggable आणविक तंत्र की पहचान, और EndMT के मॉडुलन के लिए स्क्रीन. यहां, हम EndMT की प्रेरण के लिए इन विट्रो विधि का वर्णन । MS-1 माउस अग्नाशय microvascular endothelial कोशिकाओं TGF के लिए लंबे समय तक जोखिम के बाद EndMT से गुजरना-β और mesenchymal मार्करों और रूपात्मक परिवर्तन के साथ ही कई भड़काऊ chemokines और साइटोकिंस की प्रेरण दिखा । microRNA (miRNA) मॉडुलन के विश्लेषण के लिए विधियाँ भी शामिल हैं. ये विधियां अंतर्निहित EndMT तंत्र और EndMT के लिए miRNAs के योगदान की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं ।

Introduction

Endothelial-mesenchymal संक्रमण (EndMT) प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक विभेदित Endothelial कोशिका आणविक परिवर्तन की एक किस्म से गुजरती है, एक fibroblast की तरह mesenchymal सेल1में जिसके परिणामस्वरूप । EndMT शुरू में दिल2,3के विकास के दौरान एक endothelial सेल परिवर्तन के रूप में वर्णित किया गया था । जल्दी दिल के विकास में, दिल ट्यूब एक भीतरी endocardium और एक बाहरी मायोकार्डियम के होते हैं । इन दो परतों extracellular मैट्रिक्स की एक परत द्वारा अलग कर रहे है कार्डियक जेली कहा जाता है । भ्रूण endocardial कोशिकाओं है, जो endothelial सेल मार्कर, mesenchymal कोशिकाओं में पारगमन प्राप्त, अंतर्निहित कार्डियक जेली आक्रमण, और हृदय कुशन के गठन को बढ़ावा देने, अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक वाल्व और पट के लिए नींव प्रदान और semilunar वाल्व । इसके अलावा, EndMT कोरोनरी वाहिकाओं, उदर महाधमनी, और फुफ्फुसीय धमनी4,5,6सहित अन्य भ्रूण संवहनी प्रणालियों में pericytes और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के स्रोत होने का सुझाव दिया गया है । इसके अलावा, EndMT शारीरिक angiogenic अंकुरण7में फंसा हुआ है ।

सबूत जमा करने का सुझाव दिया है कि EndMT भी कई हृदय रोगों और अंय रोगों में शामिल है1,8। EndMT-संबद्ध शर्तों संवहनी पत्थराना, atherosclerosis, फुफ्फुसीय धमनी का उच्च रक्तचाप, गुफा कुरूपता, अंग फाइब्रोसिस, नस भ्रष्टाचार remodeling, गुर्दा प्रत्यारोपण में allograft रोग, और8कैंसर शामिल हैं, 9,10,11,12,13,14,15,16,17 , 18. हाल की एक रिपोर्ट में वर्णित है कि कई आणविक EndMT मार्करों गुर्दा प्रत्यारोपण में गुर्दे भ्रष्टाचार रोग के निदान और पूर्वानुमान भविष्यवाणी के लिए एक उपकरण हो सकता है17. EndMT से संबंधित सेलुलर संकेतन रास्ते का मॉडुलन पशु मॉडल8,15में हृदय की फाइब्रोसिस और नस भ्रष्टाचार को फिर से मॉडलिंग सहित कई रोग की स्थिति उन्नत करने के लिए दिखाया गया है । इसलिए, EndMT अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए नैदानिक और चिकित्सीय EndMT लक्ष्यीकरण रणनीतियों का विकास महत्वपूर्ण है ।

EndMT सेल-सेल जंक्शनों के नुकसान की विशेषता है, प्रवासी क्षमता में वृद्धि, endothelial जैसे VE-cadherin के रूप में विशिष्ट जीन के downregulation, और mesenchymal-चिकनी मांसपेशी α (actin-SMA) सहित α जीन के विनियमन । इसके अलावा, EndMT और उपकला-mesenchymal संक्रमण (EMT), एक ऐसी ही प्रक्रिया है कि mesenchymal कोशिकाओं के लिए उपकला कोशिकाओं में कनवर्ट करता है, विभिन्न extracellular मैट्रिक्स घटकों के बदल उत्पादन के साथ जुड़े रहे हैं, जो विकास में योगदान कर सकते हैं के टिशू फाइब्रोसिस8,19.

हाल ही में, EndMT के कई इन विट्रो अध्ययनों में EndMT15,20के आणविक तंत्र का आविर्भाव विवरण है । EndMT विकास कारक (TGF) को बदलने सहित विभिन्न संकेतन मार्ग द्वारा प्रेरित है-β, Wnt, और पायदान1. उनमें से, TGF-β दोनों EMT और EndMT की प्रेरण में निर्णायक भूमिकाओं निभाता है । EndMT में, TGF के लिए लंबे समय तक जोखिम-β विभिन्न endothelial कोशिकाओं में EndMT में परिणाम है, जबकि कम प्रदर्शन अपर्याप्त21प्रतीत होता है. हम यहां EndMT प्रेरण, जिसमें मील स्वेन 1 (MS-1) माउस अग्नाशय microvascular endothelial कोशिकाओं के लिए एक सरल प्रोटोकॉल वर्णित EndMT में लंबे समय तक प्रदर्शन के बाद इन विट्रो में TGF-β20से गुजरना । इस मॉडल में, कई अनुप्रवाह विश्लेषण EndMT की पहचान सुविधाओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है, रूपात्मक परिवर्तन सहित, endothelial मार्करों के downregulation, mesenchymal मार्करों और भड़काऊ जीन के ऊपर, cytoskeletal rearrangement, और कोलेजन जेल संकुचन ।

MicroRNAs (miRNAs) हैं ~ 22 nt लघु विनियामक RNAs कि विभिन्न mRNA लक्ष्य के प्रत्यक्ष posttranscriptional दमन22,23. बीज अनुक्रम के माध्यम से-मध्यस्थता लक्ष्य मांयता, miRNAs लक्ष्य जीन के सैकड़ों को दबाने और इस तरह के सेल भेदभाव, प्रसार, और गतिशीलता के रूप में विविध सेलुलर कार्यों का नियमन । यह भी EMT और EndMT के विनियमन के लिए मामला है, और कई miRNAs EMT और EndMT24,25के नियामकों के रूप में सूचित किया गया है । इस समीक्षा में प्रस्तुत EndMT मॉडल को EndMT में miRNAs की भूमिकाओं का परीक्षण करने के लिए miRNA मॉडुलन प्रक्रियाओं के साथ आसानी से संयोजित किया जा सकता है. वर्तमान समीक्षा TGF-β-प्रेरित EndMT MS-1 कक्षों में जांच करने के लिए हमारी प्रायोगिक कार्यविधियों को सारांशित करता है और अन्य endothelial कक्षों में TGF-β द्वारा EndMT प्रेरण की शर्तों की तुलना भी शामिल है ।

Protocol

1. EndMT की प्रेरण मानक संस्कृति की स्थिति में एमएस-1 कोशिकाओं को बनाए रखने और प्रवाह से बचने के । एमएस-1 कोशिकाओं के एक स्रोत सामग्री की तालिकामें वर्णित है । एमएस-1 कोशिकाओं के लिए, 10% भ्रूण बछड़ा सीर…

Representative Results

TGF-β विभिन्न endothelial कोशिकाओं में EndMT का एक शक्तिशाली उत्प्रेरण है । के बाद TGF के साथ 24 एच उपचार-β MS-1 कोशिकाओं में, F-actin के लिए दाग से पता चलता है actin तनाव तंतुओं का पुनर्गठन (आंकड़ा 1a)20….

Discussion

यह सूचित किया गया है कि सक्रिय रास और TGF-β उपचार एमएस-1 कोशिकाओं में 24 एच प्रेरित EndMT के लिए, जबकि TGF-β अकेले इस छोटी अवधि21में EndMT प्रेरित करने में विफल रहा है । लगातार, हमने देखा है कि TGF-β काफी प्रेरित EndMT क?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

पांडुलिपि तैयार करने में सुझावों के लिए हम Zea Borok और मेंहै Miyazono को धन्यवाद देते हैं । H.I.S. और M.H. उएहारा मेमोरियल फाउंडेशन रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं, और H.I.S. विदेश में अध्ययन के लिए ओसामु Hayaishi मेमोरियल छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है । यह काम टाकेडा साइंस फाउंडेशन (एएस) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027
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Citar este artigo
Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).
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