Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β
Summary
Un protocollo per l’induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.
Abstract
Plasticità fenotipica delle cellule endoteliali è alla base dello sviluppo del sistema cardiovascolare, malattie cardiovascolari e varie circostanze connesse con la fibrosi dell’organo. In queste condizioni, differenziate cellule endoteliali acquisiranno fenotipi mesenchymal-like. Questo processo è chiamato transizione endoteliali mesenchimali (EndMT) ed è caratterizzato da downregulation dei marcatori endoteliali, upregulation di indicatori mesenchymal e cambiamenti morfologici. EndMT è indotta da diverse vie di segnalazione, compreso (TGF) del fattore di crescita trasformante-β, Wnt e tacca e regolata da meccanismi molecolari simili a quelli di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) importante per gastrulazione, fibrosi del tessuto, e metastasi del cancro. Comprensione dei meccanismi di EndMT è importante sviluppare approcci diagnostici e terapeutici EndMT di targeting. Induzione robusto del EndMT in vitro è utile per caratterizzare comune firme di espressione di gene, identificare meccanismi molecolari trattabili e dello schermo per modulatori di EndMT. Qui, descriviamo un metodo in vitro per l’induzione di EndMT. Le cellule endoteliali microvascolari del pancreas di mouse MS-1 subiscono EndMT dopo una prolungata esposizione a TGF-β e mostrano upregulation dei marcatori mesenchimali ed i cambiamenti morfologici così come induzione di più infiammatoria chemochine e citochine. Sono inclusi anche i metodi per l’analisi dei microRNA (miRNA) modulazione. Questi metodi forniscono una piattaforma per studiare i meccanismi alla base di EndMT e il contributo di Mirna a EndMT.
Introduction
Transizione endothelial-mesenchimale (EndMT) è il processo mediante il quale una cellula endoteliale differenziata subisce una varietà di cambiamenti molecolari, risultante in un fibroblasto-come delle cellule mesenchimali1. EndMT è stato inizialmente descritto come una trasformazione delle cellule endoteliali durante lo sviluppo del cuore2,3. Nello sviluppo iniziale del cuore, il tubo del cuore è costituito da un endocardio interno e un esterno miocardio. Questi due strati sono separati da uno strato di matrice extracellulare chiamato la gelatina cardiaca. Le cellule embrionali endocardial, che acquisiscono gli indicatori delle cellule endoteliali, transitano in cellule mesenchimali, invadono la gelatina cardiaca sottostante e promuovano la formazione dei cuscini cardiaci, fornendo le basi per le valvole atrioventricolari e setto e le valvole semilunari. Inoltre, EndMT è stata suggerita per essere fonti di periciti e cellule muscolari lisce vascolari in altri sistemi vascolare embrionale tra cui vasi coronarici, aorta addominale e dell’arteria polmonare4,5,6. Inoltre, EndMT è implicato nella fisiologico angiogenici spuntano7.
Raccogliendo la prova ha suggerito che EndMT è anche coinvolto in molteplici malattie cardiovascolari e altre malattie1,8. EndMT-collegato condizioni includono calcificazione vascolare, aterosclerosi, ipertensione arteriosa polmonare, malformazione cavernosa, fibrosi dell’organo, che ritocca dell’innesto della vena, disfunzione dell’allotrapianto in trapianto di rene e cancro8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. un recente rapporto descritto che diversi marcatori molecolari di EndMT possono essere uno strumento per la stima di diagnosi e prognosi della disfunzione renale dell’innesto nel trapianto di rene17. Modulazione delle vie di segnalazione cellulare EndMT-correlati sono stati indicati per migliorare le condizioni di malattia diversi tra cui fibrosi cardiaca e vena innesto rimodellamento in animale modelli8,15. Pertanto, la comprensione dei meccanismi sottostanti EndMT è importante sviluppare strategie diagnostiche e terapeutiche EndMT di targeting.
EndMT è caratterizzata da perdita di giunzioni della cellula-cellula, aumento potenziale migratorio, downregulation dei geni endoteliali specifici quali VE-caderina e il upregulation dei geni mesenchimali compreso actina α-liscia del muscolo (α-SMA). Inoltre, EndMT e transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), un processo simile che converte le cellule epiteliali in cellule mesenchimali, sono associati con alterata produzione di vari componenti della matrice extracellulare, che possono contribuire allo sviluppo di tessuti fibrosi8,19.
Recentemente, parecchi studi in vitro di EndMT hanno delucidato dettagli dei meccanismi molecolari di EndMT15,20. EndMT è indotta da varie vie di segnalazione compreso (TGF) del fattore di crescita trasformante-β, Wnt e tacca1. Fra loro, TGF-β svolge ruoli fondamentali nell’induzione di EMT e di EndMT. In EndMT, prolungata esposizione ai risultati di TGF-β in EndMT in varie cellule endoteliali, mentre breve esposizione sembra essere insufficiente21. Abbiamo descritto qui un semplice protocollo per induzione di EndMT, in cui miglio SVEN 1 (MS-1) cellule endoteliali microvascolari del pancreas del mouse subiscono EndMT in vitro dopo l’esposizione prolungata a TGF-β20. In questo modello, più a valle analisi possono essere eseguite per studiare le caratteristiche di marchio di garanzia di EndMT, tra cui i cambiamenti morfologici, downregulation dei marcatori endoteliali, upregulation di mesenchymal marcatori e geni infiammatori, del citoscheletro riorganizzazioni e contrazione del gel di collagene.
I microRNA (Mirna) sono ~ 22 nt piccoli RNA regolatori che dirigono posttranscriptional repressione di vari mRNA target22,23. Attraverso il riconoscimento di destinazione di sequenza-mediata del seme, Mirna sopprimono centinaia di geni bersaglio e modulano varie funzioni cellulari quali la motilità, proliferazione e differenziazione cellulare. Questo è anche il caso di regolamento di EMT ed EndMT, e diversi miRNA sono stati segnalati come regolatori di EMT ed EndMT24,25. Il modello EndMT presentato in questa recensione sono facilmente abbinabili con procedure di modulazione di miRNA per testare i ruoli di Mirna in EndMT. L’esame attuale riassume le nostre procedure sperimentali per studiare EndMT TGF-β-indotta in cellule MS-1 e include anche il confronto delle condizioni di induzione di EndMT di TGF-β in altre cellule endoteliali.
Protocol
Representative Results
Discussion
È stato segnalato che attivato trattamento Ras e TGF-β per 24 h ha indotto la EndMT in cellule di MS-1, mentre TGF-β da solo non è riuscito a indurre EndMT in questo breve periodo21. Coerentemente, abbiamo osservato che TGF-β sostanzialmente indotto EndMT dopo trattamento più lungo (48-72 h) in MS-1 cellule20. EndMT è stato più volte osservato dopo il trattamento prolungato con TGF-β (2 – 6 giorni) in varie cellule endoteliali come cordone ombelicale umano cellul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Zea Borok e Kohei Miyazono per suggerimenti in preparazione del manoscritto. H.I.S e M.H. sono supportati da Uehara Memorial Foundation Research Fellowship e H.I.S è supportato dal Osamu Hayaishi Memorial Scholarship per studiare all’estero. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione da Takeda Science Foundation (A.S.).
Materials
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
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