成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析
Summary
体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β によって誘導されます。
Abstract
内皮細胞の表現型可塑性は、心血管系システム開発、心血管疾患や臓器線維症に関連付けられている様々 な条件に基づいています。これらの条件では、差別化された血管内皮細胞は、間葉系のような表現型を取得します。この内皮間葉転換 (EndMT) と呼ばれており血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、および形態学的変化のアップレギュレーションが特徴です。形質転換成長因子 (TGF) を含むいくつかのシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、およびノッチ、原腸陥入、組織の線維化の分子メカニズム上皮間葉転換 (EMT) 重要のそれらに類似による規制とがんの転移。EndMT のメカニズムの理解は、ターゲット EndMT 診断および治療上のアプローチを開発することが重要です。EndMTの in vitroの堅牢な誘導は、一般的な遺伝子発現シグネチャを特徴付ける、druggable の分子メカニズムを特定する、EndMT の画面に便利です。ここでは、EndMT の誘導のための in vitro法について述べる。MS 1 マウス膵微小血管内皮細胞 TGF-β への長期暴露の後 EndMT を受けるし、複数の炎症性ケモカイン、サイトカインの誘導だけでなく、間葉系のマーカーと形態変化のアップレギュレーションを表示します。マイクロ Rna (miRNA) 変調の解析のためのメソッドが含まれています。これらのメソッドは、EndMT と EndMT する Mirna の貢献を根底にあるメカニズムを調査するためのプラットフォームを提供します。
Introduction
内皮間葉転換 (EndMT) は、差別化された血管内皮細胞は様々 な線維芽細胞のような間葉系細胞1分子変化を受けるプロセスです。EndMT は、当初ハート2,3の開発中に内皮細胞変換として記述されていた。心開発の初期段階、心臓の管は内部の心内膜と外側の心筋で構成されます。これらの 2 つの層は、心臓のゼリーと呼ばれる細胞外のマトリックスの層で区切られます。血管内皮細胞のマーカーを取得するには、胚の心内膜細胞間葉系細胞にトランジット、基になる心臓ゼリーに侵入して房室弁の中隔の基盤を提供する心臓のクッションの形成を促進半月弁。さらに、EndMT は、冠血管、腹部大動脈および肺動脈4,5,6を含む他の胚の血管システムのペリサイトおよび血管平滑筋細胞の源に示唆されています。さらに、EndMT、発芽7生理的血管新生に関与しています。
証拠の蓄積は、EndMT が複数の心血管疾患と他の疾患1,8にも関与していることを示唆しています。EndMT 関連付けられている条件は、血管石灰化、動脈硬化症、肺動脈高血圧症、海綿静脈奇形、臓器線維症、静脈グラフトを改造、同種移植片機能不全腎移植、癌8、します。 9,10、11,12,13,14,15,16,17, 18. 最近の報告書は、いくつかの分子 EndMT マーカーが腎臓移植17で移植腎機能障害の診断と予後予測のためのツールをすることができます説明します。EndMT 関連細胞シグナル伝達経路の変調は心筋線維化を含むいくつかの病気の条件を改善するために示されているし、8,15をモデル動物に静脈グラフトの改造します。したがって、メカニズムを理解すること基になる EndMT は、EndMT をターゲット診断と治療戦略を開発することが重要です。
EndMT は、細胞間の接合、渡り鳥の可能性の増加、VE カドヘリンなど血管内皮特異遺伝子のダウンレギュレーションと α-平滑筋アクチン (α SMA) を含む間葉系遺伝子の発現の損失によって特徴付けられます。さらに、EndMT と上皮間葉移行 (EMT)、間葉系細胞、上皮細胞に変換する同様のプロセス開発に貢献するかもしれない様々 なの細胞外マトリックス成分の変更された生産に関連付けられています。組織の線維化の8,19。
最近では、EndMT のいくつかの生体外の研究は、EndMT15,20の分子機構の詳細を解明しました。形質転換成長因子 (TGF) を含む様々 なシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、ワンランク上の1と。中でも、TGF-β は EMT と EndMT の両方の誘導に重要な役割を果たしています。EndMT、短い露光では、不十分な21と思われる中様々 な血管内皮細胞の EndMT で TGF β の結果への露出を延長しました。ここで EndMT の誘導、どのマイル スヴェン 1 (MS-1) マウス膵微小血管内皮細胞を体外でEndMT TGF-β20への長期暴露の後受ける簡単なプロトコルについて述べる。EndMT、形態学的変化、血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、炎症性遺伝子、細胞骨格のアップレギュレーションの認刻極印の特徴を検討するこのモデルでは、複数のダウン ストリーム解析を実行できます。再編成とコラーゲンゲル収縮。
マイクロ Rna (Mirna) は ~ 22 nt 様々 な mRNA ターゲット22,23の転写後遺伝子抑制の直接規制 Rna。シード シーケンスを介したターゲット認識による Mirna は標的遺伝子の数百人を抑制し、細胞の分化・増殖・運動など多様な細胞機能を調節します。これはまた、EMT と EndMT の規制の場合といくつかの miRNAs は EMT と EndMT24,25の調節因子として報告されています。このレビューで提示した EndMT モデルは、簡単に EndMT の Mirna の役割をテストする miRNA 調節プロシージャと組み合わせることができます。現在レビューは MS 1 細胞における TGF β 誘導 EndMT を調査するための実験プロシージャを要約しも他の血管内皮細胞における TGF-β の EndMT 誘導条件の比較が含まれています。
Protocol
Representative Results
Discussion
それは 24 時間活性化 Ras および TGF-β 治療による MS 1 セルで EndMT である TGF-β 単独でこの短い期間21EndMT を誘導するために失敗したことが報告されています。一貫して、TGF-β 大幅に誘導 EndMT 長い治療 (48-72 h) 後 MS 1 セル20を見ました。ひと臍帯など様々 な血管内皮細胞における TGF-β (2-6 日) との長期治療静脈内皮細胞 (株) ひと皮膚微小血管内皮細胞 (HCMEC)?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿の準備の提案、Zea ボロックと宮園浩平に感謝します。上原記念財団研究員で立替払やかサポートされてし、留学の立替払修早石記念奨学金としています。この作品は武田科学財団 (社) からの助成金によって支えられました。
Materials
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
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