Молекулярный анализ эндотелиальной мезенхимальных перехода, вызванных преобразования сигналов фактор роста β
Summary
Протокол для индукции в vitro эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT), которая является полезной для расследования сотовой сигнальных путей, участвующих в EndMT, описал. В этой экспериментальной модели EndMT вызванные лечение с TGF-β в эндотелиальных клетках MS-1.
Abstract
Фенотипические пластичности эндотелиальных клеток лежит в основе развития сердечно-сосудистой системы, сердечно-сосудистые заболевания и различные условия, связанные с фиброзом орган. В этих условиях дифференцированной эндотелиальные клетки приобретают мезенхимы как фенотипы. Этот процесс называется эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT) и характеризуется Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров, и морфологических изменений. EndMT индуцируется несколько сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и паз и регулируется молекулярные механизмы аналогичны эпителия мезенхимальных перехода (EMT) важные для гаструляция, фиброз тканей, и метастазами рака. Понимание механизмов EndMT имеет важное значение для разработки диагностических и терапевтических подходов, ориентации EndMT. Надежные индукции EndMT в vitro полезным характеризовать общим подписи выражение гена, определять druggable молекулярных механизмов и экран для модуляторы EndMT. Здесь мы описываем в vitro метод для индукции EndMT. MS-1 мыши поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки проходят EndMT после увеличиваемой подвержения к TGF-β и показать upregulation мезенхимальных маркеров и морфологические изменения, а также индукции несколько воспалительных chemokines и цитокинов. Также включены методы для анализа микроРНК (miRNA) модуляции. Эти методы предоставляют платформу для изучения механизмов лежащих в основе EndMT и вклад адаптивной к EndMT.
Introduction
Эндотелия мезенхимальных переход (EndMT) является процессом, в котором дифференцированной эндотелиальных клеток проходит целый ряд молекулярных изменений, что приводит к фибробластоподобных мезенхимальных клеток1. Первоначально EndMT был описан как преобразование эндотелиальных клеток во время разработки в сердце2,3. В начале развития сердца сердце трубка состоит из эндокарда внутренний и наружный миокарде. Эти два слоя разделены слоем внеклеточного матрикса, называется сердечной желе. Эмбриональные клетки эндокарда, которые приобретают эндотелиальных клеток маркеры, транзита в Мезенхимальные клетки, вторгнуться базовой сердца желе и способствуем формированию сердца подушки, создавая основу для Предсердно-желудочковые клапаны и перегородки и Полулунные клапаны. Кроме того было предложено EndMT быть источники pericytes и сосудистой гладкой мышечной клетки в других эмбриональной сосудистой системы, включая коронарных сосудов, брюшной аорты и легочной артерии4,5,6. Кроме того EndMT причастны физиологических ангиогенных прорастания7.
Накапливая доказательства предположил, что EndMT также участвует в нескольких сердечно-сосудистых заболеваний и других болезней1,8. EndMT связанного условия включают сосудистой кальцификации, атеросклероз, легочной артериальной гипертензии, кавернозных мальформация, орган фиброз, вен трансплантата Ремоделирование, аллотрансплантатом дисфункции в трансплантации почки и рак8, 9,10,11,12,13,14,,1516,17, 18. недавнем докладе говорится, что несколько молекулярных маркеров EndMT может быть инструментом для диагностики и прогноза предсказания дисфункции почек трансплантата в почечной трансплантации17. Модуляции клеточных сигнальных путей, связанных с EndMT было показано для улучшения несколько условий болезни, включая фиброз сердца и вен трансплантата Ремоделирование в животных моделей8,15. Таким образом понимание механизмов базовой EndMT важно развивать диагностические и терапевтические стратегии, ориентированные EndMT.
EndMT характеризуется потерей ячеек развязок, увеличение миграционным потенциалом, Даунрегуляция эндотелиальной конкретных генов как ве Кадгерины и upregulation мезенхимальных генов, включая актина α-гладких мышц (α-SMA). Кроме того EndMT и эпителия мезенхимальных перехода (EMT), аналогичный процесс, который преобразует эпителиальных клеток мезенхимальных клеток, связаны с измененной производства различных компонентов внеклеточного матрикса, которые могут внести вклад в развитие 8,фиброз тканей19.
Недавно несколько исследований в пробирке EndMT раскрыты подробности молекулярных механизмов EndMT15,20. EndMT индуцируется различных сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и надрезать1. Среди них TGF-β играет ключевую роль в индукции EMT и EndMT. В EndMT продолжительное воздействие TGF-β результаты в EndMT в различных эндотелиальных клеток, в то время как короткие выдержки, как представляется, недостаточно21. Здесь мы описали простой протокол для индукции EndMT, в которых Свен 1 миля (МС-1) поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши пройти EndMT в vitro после увеличиваемой подвержения к TGF-β20. В этой модели можно выполнить несколько ниже по течению анализа расследовать отличительной черты EndMT, в том числе морфологические изменения, Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров и воспалительные гены, цитоскелета перестановки и сокращение гель коллагена.
МикроРНК (интерферирующим) являются ~ 22 nt малых регулирования РНК, которые направляют посттранскрипционного репрессии в отношении различных мРНК целей22,–23. Через признание целевой последовательности опосредованной семян адаптивной подавить сотни целевых генов и модулировать различных клеточных функций, таких как дифференцировки клеток, распространением и подвижности. Это также касается регулирования EMT и EndMT, и несколько интерферирующим были зарегистрированы как регуляторы EMT и EndMT24,25. EndMT модель, представленная в этом обзоре можно легко комбинируется с Мирна модуляции процедур для проверки роли интерферирующим в EndMT. Настоящий обзор обобщает наши экспериментальные процедуры расследования TGF-β-индуцированной EndMT в клетках MS-1 и также включает в себя сравнение условий EndMT индукции, TGF-β в других эндотелиальных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сообщается, что активированные ран и TGF-β лечения для 24 h индуцированных EndMT в клетках МС-1, в то время как TGF-β только удалось побудить EndMT в этот короткий период21. Последовательно мы наблюдали, что TGF-β существенно индуцированных EndMT после длительного лечения (48-72 ч) в MS-1 клетки<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Zea Борок и Kohei Miyazono за предложения по подготовке рукописи. H.I.S. и M.H. поддерживаются Уэхара Мемориальный фонд исследовательских стипендий, и H.I.S. поддерживается Осаму Hayaishi Мемориал стипендии для обучения за рубежом. Эта работа была поддержана грант от фонда науки Такеда (А.С).
Materials
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
Referências
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Biologia do Desenvolvimento. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Pesquisa do Câncer. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs–the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Pesquisa do Câncer. 75 (7), 1244-1254 (2015).
