Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β
Summary
Se describe un protocolo para la inducción en vitro de transición endotelio-mesénquima (EndMT), que es útil para la investigación de vías de señalización celulares involucradas en EndMT. En este modelo experimental, EndMT es inducida por el tratamiento con TGF-β en las células endoteliales MS-1.
Abstract
Plasticidad fenotípica de las células endoteliales es la base de desarrollo del sistema cardiovascular, enfermedades cardiovasculares y diversas condiciones asociadas con fibrosis del órgano. En estas condiciones, las células endoteliales diferenciadas adquieren mesenquimales como fenotipos. Este proceso se llama transición endotelio-mesénquima (EndMT) y se caracteriza por el downregulation de marcadores endoteliales, upregulation de marcadores mesenquimales y cambios morfológicos. EndMT es inducida por varias vías de señalización, incluyendo transformación de factor de crecimiento (TGF)-β, Wnt y Notch y regulados por mecanismos moleculares similares a los de transición epitelial-mesenquimal (EMT) importante para el gastrulation, fibrosis del tejido, y metástasis del cáncer. Comprensión de los mecanismos de EndMT es importante para desarrollar enfoques diagnósticos y terapéuticos dirigidos a EndMT. Fuerte inducción de EndMT en vitro es útil para caracterizar las firmas de expresión de genes comunes, identificar los mecanismos moleculares druggable y pantalla para moduladores de EndMT. Aquí, describimos un método en vitro para la inducción de EndMT. Células endoteliales microvasculares pancreático de ratón MS-1 se someten a EndMT después de la exposición prolongada a TGF-β y mostrar upregulation de marcadores mesenquimales y cambios morfológicos, así como la inducción de citoquinas y quimiocinas inflamatorias múltiples. También se incluyen métodos para el análisis de microARN (miARN) modulación. Estos métodos proporcionan una plataforma para investigar mecanismos subyacentes a EndMT y el aporte de miRNAs a EndMT.
Introduction
Transición mesenquimal endotelial (EndMT) es el proceso por el que un distinguido de la célula endotelial sufre una variedad de cambios moleculares, lo que resulta en un fibroblasto-como de células mesenquimales1. EndMT fue descrito inicialmente como una transformación de la célula endotelial durante el desarrollo del corazón2,3. En el temprano desarrollo del corazón, el tubo del corazón consiste en un endocardio interno y un externo miocardio. Estas dos capas están separadas por una capa de matriz extracelular llamada la gelatina cardiaca. Las células embrionarias del Canal auriculoventricular, que adquieren marcadores de células endoteliales, tránsito en las células mesenquimales, invaden la gelatina cardiaca subyacente y promoción la formación de las almohadillas cardiacas, proporcionando la base para las válvulas auriculoventriculares y tabique y las válvulas semilunares. Además, EndMT ha sugerido que las fuentes del pericitos y células musculares lisas vasculares en otros sistemas vasculares embrionarios incluyendo los vasos coronarios, aorta abdominal y arteria pulmonar4,5,6. Además, EndMT está implicado en angiogénicos fisiológicos germinación7.
Acumulación de evidencia ha sugerido que EndMT también está implicado en varias enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades1,8. Afecciones asociadas con la EndMT incluyen calcificación vascular, aterosclerosis, hipertensión arterial pulmonar, malformación cavernosa, fibrosis del órgano, remodelación de injerto de vena, disfunción del aloinjerto en trasplante de riñón y cáncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. un informe reciente describió que varios marcadores moleculares de EndMT pueden ser una herramienta para la predicción del diagnóstico y pronóstico de la disfunción del injerto renal en riñón trasplante17. Modulación de vías de señalización celulares relacionados con el EndMT se han demostrado para mejorar varias condiciones de enfermedad incluyendo fibrosis cardiaca y vena del injerto remodelación en animales modelos8,15. Por lo tanto, comprensión de los mecanismos EndMT subyacente es importante desarrollar estrategias diagnósticas y terapéuticas dirigidas a EndMT.
EndMT se caracteriza por la pérdida de las ensambladuras de la célula, aumento en el potencial migratorio, desregulación de genes endoteliales específicos como VE-cadherina y upregulation de los genes mesenquimales incluyendo la actinia del músculo liso de α (α-SMA). Además, EndMT y transición epitelial-mesenquimal (EMT), un proceso similar que convierte las células epiteliales para las células mesenquimales, se asocian con producción alterada de los diversos componentes de la matriz extracelular, que pueden contribuir al desarrollo de tejido fibrosis8,19.
Recientemente, varios estudios en vitro de EndMT han aclarado los detalles de los mecanismos moleculares de la EndMT15,20. EndMT es inducida por varias vías de señalización como transformación de factor de crecimiento (TGF)-β, Wnt y muesca1. Entre ellos, TGF-β juega un papel fundamental en la inducción de la EMT y EndMT. En EndMT, la exposición prolongada a resultados de TGF-β en EndMT en diversas células endoteliales, mientras que el corto de la exposición parece ser insuficiente21. Aquí describimos un protocolo sencillo para la inducción de EndMT, en que 1 milla de SVEN (MS-1) células endoteliales microvasculares pancreáticas de ratón se someten a EndMT en vitro después de la exposición prolongada a TGF-β20. En este modelo, se pueden realizar múltiples análisis aguas abajo para investigar características del sello de EndMT, incluyendo cambios morfológicos, downregulation de marcadores endoteliales, upregulation de los genes inflamatorios, citoesqueleto y marcadores mesenquimales los cambios y contracción del gel de colágeno.
MicroRNAs (miRNAs) son ~ 22 nt small RNAs reguladoras que represión postranscripcional de varios mRNA objetivos22,23. A través del reconocimiento de semillas mediada por la secuencia blanco, miRNAs suprimir cientos de genes diana y modula diversas funciones celulares como la diferenciación celular, proliferación y motilidad. Este es también el caso para la regulación de la EMT y EndMT, y varios miRNAs se han divulgado como reguladores de la EMT y EndMT24,25. El modelo de EndMT presentado en esta revisión se puede combinar fácilmente con procedimientos de la modulación de miRNA para probar las funciones de miRNAs en EndMT. La presente revisión resume los procedimientos experimentales para investigar EndMT inducida por el TGF-β en las células MS-1 y también incluye la comparación de las condiciones de inducción de EndMT por TGF-β en otras células endoteliales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha divulgado que activado tratamiento Ras y TGF-β durante 24 h inducida por EndMT en células de MS-1, mientras que TGF-β solo ha podido inducir EndMT en este corto período21. Constantemente, observamos que TGF-β sustancialmente inducida por EndMT después de un tratamiento más largo (48-72 h) en MS-1 células20. EndMT se ha observado repetidamente después de tratamiento prolongado con TGF-β (2-6 días) en diversas células endoteliales como umbilical humana de la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Zea Borok y Kohei Miyazono sugerencias en la preparación del manuscrito. H.I.S. y M.H. son compatibles con la beca de investigación Fundación Uehara Memorial y H.I.S. es apoyada por Osamu Hayaishi Memorial Scholarship para estudio en el extranjero. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de ciencia de Takeda (A.S.).
Materials
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
Referências
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Biologia do Desenvolvimento. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Pesquisa do Câncer. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs–the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Pesquisa do Câncer. 75 (7), 1244-1254 (2015).
