Hier presenteren we en contrast twee protocollen gebruikt om te decellularize van plantaardige weefsels: een wasmiddel gebaseerde aanpak en een wasmiddel-vrije benadering. Beide methoden zijn achterlaten van de extracellulaire matrix van de weefsels van de plant gebruikt, die vervolgens kan worden gebruikt als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.
De transplantaties van het autologe, synthetische en dierlijke momenteel gebruikt als steigers voor weefsel vervanging hebben beperkingen als gevolg van lage beschikbaarheid, arme biocompatibiliteit en kosten. Plantaardige weefsels hebben gunstige kenmerken die ze uniek geschikt voor gebruik als steigers, zoals hoge oppervlakte, uitstekende water transport en retentie, onderling verbonden porositeit, vasculaire netwerken, en een breed scala van mechanische kader van onderzoekopleiding Eigenschappen. Twee succesvolle methoden van plant decellularization voor weefsel waterbouwkundige toepassingen worden hier beschreven. De eerste methode is gebaseerd op wasmiddel baden om cellulaire kwestie, die vergelijkbaar met de eerder vastgestelde methoden gebruikt is om duidelijk zoogdieren weefsels. De tweede is een wasmiddel-vrije methode aangepast van een protocol dat isoleert blad therapieën en impliceert het gebruik van een verwarmde bleekmiddel en zout bad om te wissen van de bladeren en stengels. Beide methoden leveren steigers met vergelijkbare mechanische eigenschappen en de lage cellulaire metabole effecten waardoor de gebruiker kan het protocol dat beter aansluit bij hun beoogde toepassing selecteren.
Weefselengineering ontstaan in de jaren 1980 maken levend weefsel substituten, en potentieel adres belangrijke orgaan- en weefsel tekorten1. Een strategie hanteert steigers te stimuleren en begeleiden van het lichaam om te regenereren ontbrekende weefsels of organen. Hoewel geavanceerde productie benaderingen zoals 3D-printen steigers met unieke fysieke eigenschappen hebben geproduceerd, blijft de mogelijkheid voor de vervaardiging van steigers met een breed scala van haalbare fysische en biologische eigenschappen een uitdaging2 , 3. Bovendien, als gevolg van een gebrek aan een functionele vasculaire netwerk, deze technieken hebben beperkt gebleven in het regenereren van 3-dimensionale weefsels. Het gebruik van decellularized dierlijke en menselijke weefsels als steigers heeft geholpen in het omzeilen van dit probleem4,5,6,7. Echter hoge kosten-charges-variabiliteit en beperkte beschikbaarheid kunnen het beperken van wijdverbreide gebruik van decellularized dier steigers8. Er bestaat ook bezorgdheid over mogelijke overdracht van de ziekte aan patiënten en immunologische reactie op sommige decellularized zoogdieren weefsels9.
Cellulose, afgeleid van plant en bacteriële bronnen, is uitgebreid gebruikt voor het genereren van biomaterialen voor een brede waaier van toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Enkele voorbeelden zijn: bot, kraakbeen12,13,14 ,10,11en wond genezing van15. Steigers die bestaan van cellulose hebben een bijkomend voordeel dat ze zijn duurzaam en resistent tegen cellen van zoogdieren wordt uitgesplitst. Dit is vanwege het feit dat zoogdiercellen geen produceren de enzymen die nodig is voor het uitsplitsen van cellulose moleculen. Ter vergelijking, steigers geproduceerd met behulp van macromoleculen uit de extracellulaire matrix, zoals collageen, worden gemakkelijk afgebroken16 en mogelijk niet geschikt zijn voor langdurige toepassingen. Collageen steigers kunnen worden gestabiliseerd door chemische dwarsbinding. Er is echter een trade-off als gevolg van de inherente toxiciteit van de cross-linkers die invloed hebben op de biocompatibiliteit van de steigers17. Omgekeerd, cellulose heeft het potentieel om te blijven aanwezig op de plaats van implantatie voor langdurig van tijd, want het is ongevoelig voor enzymatische afbraak door zoogdiercellen18,19,20. Dit kan worden gewijzigd door het afstemmen van het tarief van aantasting door middel van hydrolyse voorbehandeling en co levering van de steigers met cellulases21. De biocompatibiliteit van decellularized plantgerelateerde cellulose steigers in vivo is ook aangetoond in een studie gedaan op muizen22.
Door honderden miljoenen jaren van evolutie, hebben planten hun structuur en samenstelling te verhogen van de efficiëntie van vloeibare vervoer en bewaring verfijnd. Plant vasculaire vaartuigen minimaliseren hydraulische weerstand door vertakking naar kleinere schepen, vergelijkbaar met de zoogdieren therapieën volgens Murray’s wet23. Na decellularization, wordt van de plant complex netwerk van vaartuigen en onderling verbonden poriën onderhouden. Gezien het grote aantal verschillende plantensoorten beschikbaar hebben plantgerelateerde steigers het potentieel om te overwinnen ontwerpbeperkingen, beïnvloeden momenteel steigers in weefsel engineering24,25. Bijvoorbeeld, Modulevsky et al. aangetoond dat angiogenese en cel migratie gebeurde toen decellularized apple weefsel subcutaan werd ingeplant op de achterkant van een muis-22. Ook Gershlak et al. toonde aan dat endotheliale cellen kunnen volwassen binnen de therapieën van decellularized bladeren24. In een afzonderlijk experiment waren Gershlak et al. ook kunnen laten zien dat cardiomyocytes kon worden gekweekt op het oppervlak van bladeren en waren in staat om een contract van24.
Planten bevatten ook complexe organisatie van de cellulaire naar de macroscopische schaal, die moeilijk is te bereiken zelfs met de meest geavanceerde productie-technieken ontwikkeld tot nu toe. De complexe hiërarchische ontwerp van plantaardige weefsels maakt hen sterker is dan de som van hun kiezers26. Planten bezitten een overvloed aan verschillende mechanische eigenschappen, variërend van stijve en taai componenten zoals stengels, bladeren aan veel meer flexibel en plooibaar degenen zoals27. Bladeren variëren, afhankelijk van de soorten in termen van grootte, vorm, sterkte, de mate van vascularisatie, breken en kunnen verschillende graden van hydrophilicity. Over het geheel genomen, suggereren de eigenschappen van deze plant dat decellularized planten als unieke en zeer functionele medische hulpmiddelen dienen kunnen, met inbegrip van als weefsel engineering van steigers.
Dit protocol richt zich op twee methoden om te decellularize van plantaardige weefsels, zoals bladeren en stengels, voor gebruik als steigers in weefselengineering. De eerste methode is een wasmiddel gebaseerde techniek die maakt gebruik van een reeks van Baden om DNA en cellulaire kwestie, die werd aangepast van een veel gebruikte techniek om decellularize zoogdieren en plantaardige weefsels6,22,25 te verwijderen ,28,29,30. De tweede methode is wasmiddel-vrij en is aangepast van een protocol van de “skeletonization” gewoonlijk gebruikt voor het verwijderen van de zachte weefsels van bladeren31. Voorafgaande werk bleek dat scheiding van de therapieën van de omliggende weke delen31sudderen bladeren in een bleekmiddel, en natriumbicarbonaat oplossing vergemakkelijkt. Deze techniek kan worden aangehaald terug naar experimenten uitgevoerd in de 17th ptth 18 eeuwen, zoals het werk van Albertus Seba32 en Edward Parrish33. Deze experimenten gecentreerd rond het verlaten van plantaardig materiaal, zoals bladeren en vruchten, ondergedompeld in water voor langere tijd (weken tot maanden) en waardoor de zachtere tissues aan verval weg natuurlijk. Hier is de “skeletonization”-benadering aangepast voor het gebruik van mildere omstandigheden, zoals langere incubatietijd tijden bij lagere temperaturen, cellulaire resten te verwijderen en om te voorkomen dat aanzienlijk verstoren de weke delen structuur. Voor de experimenten hierin gedetailleerd, drie installatie types werden gebruikt: Ficus hispida, Pachira aquatica en een soort Garcinia. Resultaten van DNA kwantificering, mechanische tests en impact op de cellulaire metabole activiteit van beide methoden worden beschreven.
Hierin worden twee methoden om te decellularize van plantaardige weefsels beschreven. De resultaten die hier gepresenteerd in combinatie met de resultaten van voorafgaande studies25, suggereren dat de protocollen uitwaardigen waarschijnlijk zijn die van toepassing zijn op een breed spectrum van plantensoorten en kunnen worden uitgevoerd op zowel de stengels en de bladeren. Deze procedures zijn eenvoudig en vereisen geen speciale apparatuur, zodat plant decellularization in de meeste laboratoria ka…
The authors have nothing to disclose.
We zouden graag bedanken John Wirth van de tuinen van Olbrich voor genadig leveren de specimens die in dit project worden gebruikt. Dit werk is deels gesteund door de National Heart, Lung en bloed Instituut (R01HL115282 naar G.R.G.) National Science Foundation (DGE1144804 J.R.G en G.R.G.), en de Universiteit van Wisconsin afdeling chirurgie en Alumni Fonds (H.D.L.). Dit werk was ook gedeeltelijk ondersteund door de Environmental Protection Agency (STAR grant nr. 83573701), de National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 en UH3TR000506) en de National Science Foundation (IGERT DGE1144804).
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
DMEM | Corning | MT50003PC | |
Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |