JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

Published: May 31, 2018
doi:
10.3791/57586
, , , , ,
1Department of Surgery,University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation,University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering,University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering,Worcester Polytechnic Institute

Summary

Burada mevcut ve bitki dokularında decellularize için kullanılan kontrast iki protokolleri: deterjan temelli bir yaklaşım ve deterjan-Alerjik bir yaklaşım. Her iki yöntem sonra doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanılabilir hücre dışı matriks kullanılan, bitki dokuların geride.

Abstract

Şu anda iskele doku yerine kullanılan otolog, sentetik ve hayvan kaynaklı greft nedeniyle düşük kullanılabilirlik, zavallı biyouyumluluk ve maliyet kısıtlamaları bulunmaktadır. Bitki doku yapmak onları benzersiz olarak uygun yüksek yüzey alanı, mükemmel su taşıma ve saklama, gibi iskele olarak birbirine bağlı gözeneklilik, damar ağları ve çok çeşitli mekanik önceden kullanmak uygun özelliklere sahip özellikleri. Doku mühendisliği uygulamaları için bitki decellularization iki başarılı yöntemleri burada açıklanmıştır. Birinci yöntem daha önce kurulan yöntemleri memeli dokuları temizlemek için kullanılan benzer hücresel madde kaldırmak için deterjan banyoları temel alır. İkinci yaprak damarlara yalıtır ve ısıtmalı çamaşır suyu ve sapları ve yaprakları temizlemek için tuz banyosu kullanımı içerir bir protokol adapte deterjan-Alerjik bir yöntemdir. Her iki yöntem iskele karşılaştırılabilir mekanik özellikleri ve böylece daha iyi onların amaçlanan uygulama uygun protokol seçmesini sağlayan düşük hücresel metabolik etkisi ile verim.

Introduction

Doku mühendisliği canlı bir doku oluşturmak için 1980’lerde ortaya çıkan yerine ve potansiyel olarak adres önemli organ ve doku sıkıntısı1. Bir strateji iskele teşvik ve vücut eksik doku veya organ yeniden oluşturmak için rehber kullandı. 3-b baskı üretilen benzersiz fiziksel özellikleri ile iskele gibi yaklaşımlar üretim gelişmiş rağmen iskele ile ulaşılabilir fiziksel ve biyolojik özellikleri çeşitli bir yelpazede üretim yeteneği mücadelesi2 kalır , 3. Ayrıca, işlevsel bir damar ağı eksikliği nedeniyle, bu teknikleri 3 boyutlu doku Yenileyici sınırlı. İskele olarak decellularized hayvan ve insan doku kullanımı bu sorun4,5,6,7engellemeyi destekli. Ancak, yüksek maliyet, toplu iş toplu iş değişkenliği ve sınırlı kullanılabilirliğe yaygın kullanımını sınırlayabilir decellularized hayvan iskele8. Ayrıca potansiyel hastalık iletim hastalara ve bazı decellularized memeli doku9immünolojik tepki hakkında endişeler vardır.

Bitki ve bakteriyel kaynaklardan elde edilen selüloz, kapsamlı rejeneratif tıp Biyomalzeme geniş bir uygulama yelpazesi için oluşturmak için kullanılmıştır. Bazı örnekler şunlardır: kemik10,11, kıkırdak12,13,14 ve15şifa yara. Dayanıklı ve memeli hücreleri tarafından kırık aşağı için dayanıklı olduğu oluşmaktadır iskele selüloz bir yararı yok. Gerçeğini memeli hücreleri selüloz molekülleri kırmak gerekli enzimler üretmek değildir nedeniyle bu. İçinde karşılaştırma, iskele oluştururlar kollajen gibi hücre dışı matriks kullanarak üretilen16 kolayca kırık ve uzun vadeli uygulamalar için uygun olmayabilir. Kollajen iskele kimyasal cross-linking tarafından stabilize. İskele17biyouyumluluk etkiler cross-linkers doğasında toksisite nedeniyle bir ticaret-off be. Diğer taraftan, selüloz dışındahiç bir şeyden etkilenmez memeli hücreleri18,19,20enzimatik bozulma olduğundan süre takmaktan implantasyonu sitesinde mevcut kalır potansiyeline sahiptir. Bu bozulma ile hidroliz Önarıtma oranı ve iskele cellulases21ile ortak teslim ayarlama tarafından değiştirilebilir. Decellularized bitki elde edilen selüloz iskele vivo içinde biyouyumluluk da fareler22tarihinde yapılan bir çalışmada gösterilmiştir.

Milyonlarca yıllık evrim, kendi yapısı ve sıvı taşıma ve saklama verimliliğini artırmak için kompozisyon bitkiler iyileştirdiyseniz. Bitki vasküler gemiler hidrolik direnç küçük gemi, Murray’nın hukuk23göre memeli damarlara benzer içine dallanma tarafından en aza indirmek. Decellularization sonra fabrika gemileri ve birbirine bağlı gözenekleri karmaşık ağ korunur. Farklı bitki türü hazır çok sayıda göz önüne alındığında, bitki kaynaklı iskele iskele doku mühendisliği24,25Şu anda etkileyen tasarım sınırlamalarının üstesinden gelir potansiyeline sahip. Örneğin, Modulevsky vd. decellularized elma doku subkutan bir fare22arkasında implante zaman anjiogenez ve hücre göç oluştuğunu gösterdi. Benzer şekilde, Gershlak ve ark. endotel hücreleri decellularized yaprakları24damarlara içinde yetiştirilen olabilir gösterdi. Ayrı bir deneyde, Gershlak vd. Ayrıca cardiomyocytes yaprak yüzeyinde büyümüş olabilir ve24sözleşme başardık göstermek mümkün.

Bitkiler de hücresel karmaşık kuruluştan bile bugüne kadar geliştirilen en ileri üretim teknikleri ile elde etmek zordur makroskopik ölçekli içerir. Bitki doku karmaşık hiyerarşik tasarımı onları onların bileşenlerinin26toplamından daha güçlü yapar. Bitkiler bir bolluk kaynaklanıyor gibi katı ve sert bileşenleri arasında değişen farklı mekanik özelliklere sahip, çok daha esnek ve bükülebilir olanlar gibi27bırakır. Yaprakları tür boyutu açısından bağlı olarak değişiklik gösterebilir, şekli, gücü, vaskülarizasyon, derecesini kırmak ve hydrophilicity farklı derecelerde taşıyabilir. Genel olarak, bu bitki özellikleri decellularized bitkiler iskele mühendislik doku da dahil olmak üzere benzersiz ve çok fonksiyonel tıbbi cihaz olarak hizmet verebilir tavsiye ederim.

Bu iletişim kuralı bitki doku decellularize için iki yöntem üzerinde duruluyor, gibi bırakır ve doku mühendisliği iskele olarak kullanmak için kaynaklanıyor. İlk yöntem bir dizi banyoları DNA ve memeli decellularize ve doku6,22,25 bitki için yaygın olarak kullanılan bir teknik adapte hücresel madde kaldırmak için kullanan bir deterjan tabanlı tekniktir ,28,29,30. İkinci yöntem deterjan-alerjik ve genellikle yumuşak doku yaprakları31kaldırmak için kullanılan bir “iskeletleşmiş” kuralından uyarlanmıştır. Ön çalışma yaprakları çamaşır suyu ve sodyum bikarbonat bir çözümde kaynayan damarlara ayrılması çevreleyen yumuşak doku31kolaylaştırdı gösterdi. Bu teknik geri 17inci ve 18inci yüzyıl, Albertus Seba32 ve Edward Parrish33çalışmalarını gibi yapılan deneyler için verilebilir. Bitki oldu, yaprak ve meyve gibi bırakarak etrafında merkezli bu deneyler için uzun bir süre suda Batık (hafta ay) ve uzak doğal çürüme daha yumuşak dokularda izin. Burada “iskeletleşmiş” yaklaşım hücresel artıkları kaldırmak için ve yumuşak doku yapısı önemli ölçüde etkilemesini önlemek için daha düşük sıcaklıklarda uzun kuluçka süreleri gibi daha hafif koşulları kullanmak için uyarlanmıştır. Burada detaylı deneyler için üç bitki türleri kullanılmıştır: Ficus hispida, Pachira aquatica ve Garciniabir tür. DNA miktar, mekanik test ve her iki yöntem üzerinden hücresel metabolik aktivite üzerindeki etkisi sonuçları açıklanmıştır.

Protocol

1. decellularization deterjan dayalı yaklaşım kullanarak bitki dokusunun Taze veya dondurulmuş F. hispida, yaprak örnekleri kullanın. -20 ° C-dondurucu ve store (en fazla bir yıl) ileride kullanmak üzere kullanılmayan taze örnekler dondur.Not: neredeyse istenen herhangi bir bitki kök veya yaprak dokusu kullanın. Genişletilmiş depolama kez dokulara zarar verebilir. Boyutunu ve şeklini temelinde örnek’ın kullanım işleme örnekleri belirler (yani …

Representative Results

Her iki yöntem hücre kültürü ve doku mühendisliği uygulamaları için uygun iskele vermiştir. Şekil 1 decellularization süreci için deterjan tabanlı ve kesim örnekleri (8 mm çap) deterjan ücretsiz yöntemi için sağlam bir yaprak kullanarak genel iş akışını gösterir. Her iki yöntem takip Ficus hispida dokuların başarılı decellularization açık ve sağlam örnekleri (Şekil 1A ve 1B</st…

Discussion

Burada, bitki doku decellularize için iki yöntem açıklanmaktadır. Burada anlatılan sonuçları önceki çalışmalar25, sonuçları ile birleştiğinde ortaya koymak protokolleri muhtemeldir önermek geniş bir yelpazede uygun bitki tür ve sapları ve yaprakları üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu yordamları basit ve bitki decellularization çoğu laboratuvarlarında yürütülen olabilir bu yüzden özel ekipman gerektirmez. Bu decellularization sonra iskele memeli hücre adezyon kolayl…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

John Wirth bahçeleri Olbrich nezaketle bu projede kullanılan numuneler temini için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kısmen Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü tarafından desteklenen (G.R.G. R01HL115282) Ulusal Bilim Vakfı (DGE1144804) J.R.G ve G.R.G. ve Wisconsin Üniversitesi cerrahi departmanı ve mezunlar Fonu (H.D.L.). Bu eser de kısmen çevre koruma ajansı (yıldız hibe no. 83573701), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL093282-01A1 ve UH3TR000506) ve Ulusal Bilim Vakfı (IGERT DGE1144804) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray’s law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  32. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  33. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  34. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  35. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  36. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  38. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  39. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  40. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. . Biology of Plants. , (2005).
  41. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Keywords: DecellularizationF. HispidaSDSNon-ionic SurfactantBleachSodium BicarbonateScaffoldBiomaterialsUltra-structureScalable Manufacturing
check_url/pt/57586?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image