GPC3--استهداف جسم بيسبيسيفيك، GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية، مع سيتوتوكسيسيتي قوية
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج جسم بيسبيسيفيك GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية في الإشريكيّة القولونية. تنقية GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية قد سيتوتوكسيسيتي قوية ضد خلايا سرطان الكبد الإيجابية GPC3.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول البناء والدراسات الفنية لجسم بيسبيسيفيك (بسب)، GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية. يمكن التعرف على بسابس اثنين [ابيتوبس] مختلفة من خلال أسلحتهم مختلفة اثنين. وقد درست بسابس بنشاط لقدرتها على توظيف مباشرة الخلايا المناعية لقتل الخلايا السرطانية. حاليا، يتم إنتاج معظم بسابس في شكل البروتينات المؤتلف، أما بسابس المحتوية على Fc أو مشتقات بسب أصغر دون منطقة Fc. في هذه الدراسة، صمم GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية، جسم بيسبيسيفيك استناداً إلى جزء (القوات المسلحة البوروندية) الأجسام المضادة، التي تربط بين القوات المسلحة البوروندية جسم GPC3 مكافحة GC33 مع جسم مجال مفرد مكافحة CD16. يمكن المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية وتنقيته قبل سنتين تقارب تشروماتوجرافيس. يمكن على وجه التحديد ربط المنقي GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية وتقتل خلايا سرطان الكبد إيجابية GPC3 بتجنيد الخلايا القاتلة الطبيعية، مما يوحي إمكانية تطبيق GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية في علاج سرطان الكبد.
Introduction
[مونوكلونل] الآن تستخدم على نطاق واسع ل علاج السرطان1. بسبب مرونة الأجسام المضادة، تم استكشاف أشكال مختلفة تستند إلى جسم بنشاط. وبالمقارنة مع الأجسام المضادة، قد بسابس اثنين من وحدات الربط مستضد مختلفة، تمكينهم من التعرف على اثنين من أهداف مختلفة في وقت واحد وكفاءة الزناد تجنيد الخلايا المناعية المستجيب لاستهداف وقتل الخلايا السرطانية2.
يمكن تعيين تنسيقات بسب المؤتلف الحالية عموما إلى فئتين: بسابس المحتوية على نادي وبسابس دون منطقة Fc. بالمقارنة مع تنسيقات المحتوية على لجنة التيسير التي يتم إنتاجها في الغالب في خلايا الثدييات، بسابس دون منطقة Fc لها مزايا أحجام أصغر، يتم إنتاجها بسهولة أكبر في نظم التعبير الكائنات الدقيقة، ويمكن اختراق أنسجة الورم أكثر كفاءة 3.
بسابس دون منطقة Fc تتشكل عادة عن طريق ربط مويتيس ملزم الفردية، مثل شظايا متغير سلسلة مفردة (سكففس) أو الشؤون3. دون استقرار المجالات، بسابس استناداً إلى شظايا سكفف غالباً ما يكون الخطر الثبات الحراري، وانخفاض معدلي الذوبان، أو زيادة احتمال تجميع4،5. وفي المقابل، المستندة إلى القوات المسلحة البوروندية بسابس أكثر استقرارا بسبب هيتيروديميريزيشن CH1 و CL في4،moiety القوات المسلحة البوروندية الأصلي6.
المجال المتغير من الأجسام الثقيلة سلسلة فقط (فحص، كما يشار إلى مجال مفرد الأجسام المضادة) هي الجزء مستضد ملزمة النشطة من الأجسام المضادة الطبيعية الغزيرة سلسلة7. وقد فحص خصائص تقارب عالية وخصوصية التقليدية IgGs8، الاستمناع منخفضة وعالية الغلة في التعبير البكتيرية9. وبالمقارنة مع شظايا Fv، قد فحص الثبات الحراري أعلى10. وبالمقارنة مع القوات المسلحة البوروندية مويتيس، قد فحص أصغر حجماً نظراً لعدم وجود CH1 و CL. وهكذا، صمم S-القوات المسلحة البوروندية، بالشكل بسب التي تم الحصول عليها عن طريق ربط القوات المسلحة البوروندية بجسم مجال مفرد، فة، ودراسة عن الآثار المضادة للورم11،12.
في هذه الدراسة، وصف بناء GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية التي تربط بين القوات المسلحة البوروندية من hGC3313 مع فة مكافحة–CD16a14 . يمكن أن تنتج GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية كفاءة عن طريق التعبير بيريبلاسميك في الإشريكيّة القولونية (). واقترحت الدراسات الفنية من GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية أن GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية استراتيجية واعدة لعلاج سرطان الكبد. وهكذا، تشمل مزايا GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية على تقنيات بديلة مع المراجع المطبقة على الدراسات السابقة سهلة الإنتاج والتنقية، وبسابس أكثر استقرارا.
نظم التعبير الثدييات والتعبير بدائية قد استخدمت للتعبير عن مختلف أشكال بسابس. وعلى النقيض من نظم التعبير الثدييات، كولاي-أنظمة تعبير البروتين أساس لها العديد من المزايا، بما في ذلك غلة عالية، منخفضة التكلفة وتوفير العمالة، وسهولة التلاعب الجيني، وتحويل عالية الكفاءة15. بسابس التعبير في كولاي، هناك اثنين من الاستراتيجيات الأساسية: التعبير في السيتوبلازم والتعبير في بيريبلاسم بين السيتوبلازم وأغشية الخلية الخارجي15. مقارنة بالبيئة مما يقلل من السيتوبلازم، هو بيريبلاسم البيئة، التي تروج للطي الصحيحة والتعبير المشارك من البروتينات16مؤكسدة أكثر. الطي الصحيحة دوراً رئيسيا في توليد بسابس القابلية للذوبان والاستقرار ووظيفتها. ولذلك، أضيفت بيلب تسلسل إشارة N-المحطة S-القوات المسلحة البوروندية لتوجيه إفراز بيريبلاسم كولاي17. لضمان صحيحة قابلة للطي والذوبان والثبات الحراري والاستقرار كونفورماشونال، الحد من التعقيد وحجم جسم مضاد غالباً ما يلجأ16. تنسيق S-القوات المسلحة البوروندية يتكون من واحد من القوات المسلحة البوروندية وفه واحدة، التي يعبر عنها جيدا جداً في النظم البكتيرية احتمالاً بسبب هيكل بسيط وصغير الحجم.
واختير GPC3 بهذا الشكل جسم بيسبيسيفيك GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية. 3-جليبيكان (GPC3) هو عضو في الأسرة بروتيوغليكان الهيبارين كبريتات (HS) الذي يرتكز على سطح الخلية عن طريق جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)18. GPC3 أوفيريكسبريسيد في 70% حالات سرطانه الخلية الكبدية (HCC)، التي تشكل غالبية سرطانات الكبد19،20،،من2122. لأنه نادراً ما يتم التعبير عن GPC3 في أنسجة طبيعية، قد اقترح GPC3 كهدف محتمل للعقود. وتم إنتاج عدة الماوس مابس ضد GPC3. بيد أن GC33 فقط أظهرت المضادة للورم النشاط المحدود 22ولم يحمل الفعالية السريرية في المرضى. وأبدى GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية في هذه الدراسة، أن تكون قادرة على تجنيد خلايا ناغورني كاراباخ لقتل خلايا الورم GPC314.
لتعيين الخلايا ناغورني-كاراباخ، استخدمت فة مكافحة CD16. CD16a مستقبلات مفتش تقارب منخفضة، أعرب أساسا على الخلايا القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ) والضامة ووحيدات وبعض أنواع فرعية من الخلايا التائية. أنها تشارك في الخلية تعتمد على جسم سيتوتوكسيسيتي (ADCC) من ناغورني كاراباخ الخلايا23. يمكن تصنيف الخلايا البشرية في ناغورني كاراباخ إلى نوعين، CD56-CD16 + و CD56 + CD16-. وعلى النقيض من الخلايا CD56 + CD16− ناغورني كاراباخ، CD56-CD16 + “ناغورني كاراباخ” الخلايا يمكن الإفراج عن مستويات أعلى من بيرفورين وجرانزيمي ب وهكذا يقدم سيتوتوكسيسيتي قوية24. هي خلايا كوبفر (KCs)، وإذ تعرب عن CD16a، الضامة المقيم في الكبد. خلايا كوبفر دوراً هاما في مكافحة سرطان الكبد25. وهكذا، قد يكون بسابس استهداف CD16a استراتيجية واعدة أكثر من الانخراط في خلايا تي ضد سرطان الكبد.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم في هذه الدراسة، وضع استراتيجية لبناء شكل جديد من بسابس، GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية، التي يمكن أن تجند خلايا ناغورني كاراباخ استهداف الخلايا السرطانية إيجابية GPC3. S-القوات المسلحة البوروندية يستند إلى القوات المسلحة البوروندية الطبيعية تنسيق عن طريق إضافة مكافحة CD16 فة11<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل ماليا والتطوير د خطة لمقاطعة قوانغدونغ (الصين العلاقات العامة) (2016A050503028).
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Pesquisa do Câncer. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161–an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
