Vi præsenterer her, en protokol for at producere en bispecific antistof GPC3-S-Fab i Escherichia coli. Renset GPC3-S-Fab har potent cytotoksicitet mod GPC3 positive leverkræft celler.
Denne protokol beskriver opbygningen og funktionelle studier af en bispecific antistof (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs kan genkende to forskellige epitoper gennem deres to forskellige våben. bsAbs er blevet aktivt undersøgt for deres evne til at direkte rekruttere immunceller til at dræbe tumorceller. I øjeblikket, er fleste af bsAbs produceret i form af rekombinante proteiner, enten som Fc-holdige bsAbs eller som mindre bsAb derivater uden regionen Fc. I denne undersøgelse, var GPC3-S-Frederiksen, et antistof fragment (Fab) baseret bispecific antistof, designet af sammenkædning Fab af anti-GPC3 antistoffer GC33 med en anti-CD16 enkelt domæne antistof. GPC3-S-Fab kan være udtrykt i Escherichia coli og renset af to affinitet chromatographies. Renset GPC3-S-Fab kan specifikt binder til og dræbe GPC3 positive leverkræft celler ved at rekruttere natural killer celler, hvilket tyder på en potentiel anvendelse af GPC3-S-Fab i leverkræft terapi.
Monoklonale antistoffer er nu bredt anvendt for kræft behandling1. På grund af fleksibiliteten af antistoffer, har forskellige antistof-baserede formater været aktivt udforsket. Sammenlignet med monoklonale antistoffer, har bsAbs to forskellige antigen bindende moduler, så de kan genkende to forskellige mål effektivt og samtidig udløse ansættelse af immun effektor celler til at målrette og dræbe tumor celler2.
Nuværende rekombinante bsAb formater kan tildeles generelt til to klasser: Fc-holdige bsAbs og bsAbs uden en Fc region. Sammenlignet med Fc-holdige formater, der er for det meste produceret i pattedyrceller, bsAbs uden en Fc region har fordele i mindre størrelser, mere let fremstilles i mikroorganisme udtryk systemer, og kan trænge tumor væv mere effektivt 3.
bsAbs uden en Fc region dannes normalt ved at sammenkæde individuelle bindende fraspaltning, single-kæde variable fragmenter (scFvs) eller funktionelle luftrumsblokke3. Uden de stabiliserende domæner, har bsAbs baseret på scFv fragmenter ofte kompromitteret termisk stabilitet, lav opløselighed eller et større potentiale for sammenlægning4,5. Derimod er Fab-baserede bsAbs mere stabil på grund af heterodimerization af CH1 og CL i native Fab gruppe4,6.
Variabel domæne fra heavy chain kun antistoffer (VHHs, også kaldet enkelt domæne antistoffer) er den aktive antigen-bindende fragment af naturlig tunge kæde antistoffer7. VHHs har de særlige kendetegn ved høj affinitet, specificitet af konventionelle IgGs8, lav immunogenicitet og høje udbytter i bakteriel udtryk9. Sammenlignet med Fv fragmenter, har VHHs højere termisk stabilitet10. Sammenlignet med Fab fraspaltning, har VHHs mindre størrelser på grund af manglende CH1 og CL. Således var S-Frederiksen, formatet bsAb opnås ved at sammenkæde Fab med et enkelt domæne antistof, VHH, designet og undersøgt for dets anti-tumor effekt11,12.
I denne undersøgelse, blev konstruktion af GPC3-S-Fab ved at sammenkæde Fab hGC3313 med en anti-CD16a VHH14 beskrevet. GPC3-S-Fab kan effektivt produceret af periplasmic udtryk i Escherichia coli (E. coli). Funktionelle studier af GPC3-S-Fab foreslog, at GPC3-S-Fab er en lovende strategi for leverkræft terapi. Fordele ved GPC3-S-Fab over alternative teknikker med relevante henvisninger til tidligere undersøgelser omfatter således let produktion og rensning og mere stabile bsAbs.
Pattedyr udtryk og prokaryote udtryk systemer har været anvendt til at udtrykke forskellige formater af BsAbs. I modsætning til pattedyr udtryk systemer, E. coli-baseret protein udtryk systemer har mange fordele, herunder høje udbytter, lave omkostninger og arbejdskraft-besparelse, lethed af genetiske manipulationer og høj transformation effektivitet15. For bsAbs udtryk i E. coli, der er to grundlæggende strategier: udtryk i cytoplasma og udtryk i periplasm mellem cytoplasma og ydre cellemembraner15. I forhold til den reducerende miljø af cytoplasma, er periplasm en mere oxiderende miljø, som fremmer den korrekte foldning og co udtryk for proteiner16. Korrekte folde spiller en nøglerolle i opløselighed, stabilitet og funktion generation af bsAbs. Derfor, en signal sekvensen pelB blev tilføjet til N-terminus af S-Fab direkte sekretion til periplasm af E. coli17. For at sikre ansat korrekt falsning, opløselighed, termisk stabilitet og konformationelle stabilitet, reducere kompleksiteten og størrelsen af et antistof er ofte16. S-Fab format består af en Fab og én VHH, som er udtrykt udmærket i bakteriel systemer sandsynligvis på grund af den simple struktur og lille størrelse.
GPC3 blev valgt i denne GPC3-S-Fab bispecific antistof format. Glypican-3 (GPC3) er et medlem af heparin sulfat (HS) proteoglycan familie, der er forankret til celleoverfladen via glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 er overexpressed i 70% af hepatocellulært carcinom (HCC) sager, der tegner sig for størstedelen af leverkræft19,20,21,22. Fordi GPC3 er sjældent udtryk i normale væv, er GPC3 blevet foreslået som mulige mål for HCC. Flere mus mAbs tilsagnsskrivelser mod GPC3. Dog kun GC33 udstillet begrænset anti-tumor aktivitet 22, og det lykkedes ikke at udstille klinisk effekt hos patienter. I denne undersøgelse, var GPC3-S-Fab vist at kunne rekruttere NK celler for at dræbe GPC3 tumor celler14.
For at rekruttere NK celler, blev anti-CD16 VHH brugt. CD16a er en lav affinitet IgG receptor, udtrykt hovedsagelig af naturlige dræberceller (NK) celler, makrofager, monocytter og nogle undertyper af T-celler. Det er involveret i antistof-afhængige celle cytotoksicitet (ADCC) af NK celler23. NK celler kan inddeles i to typer, CD56 – CD16 + og CD56 + CD16-. I modsætning til CD56 + CD16− NK celler, CD56-CD16 + NK celler kan frigive højere niveauer af perforin og granzyme B og dermed udgøre en stærk cytotoksicitet24. Kupffer celler (KC), udtryk for CD16a, er de fastboende makrofager i leveren. Kupffer celler spiller en vigtig rolle i undertrykkelsen af leverkræft25. BsAbs rettet mod CD16a kan således være en mere lovende strategi end engagere sig T celler mod leverkræft.
I denne undersøgelse, præsenterer vi en strategi for at konstruere et nyt format for bsAbs, GPC3-S-Fab, som kan ansætte NK-celler rettet mod GPC3 positiv tumorceller. S-Fab er baseret på naturlige Fab format ved at tilføje en anti-CD16 VHH11,12. Sammenlignet med bsAbs indeholdende Fc region, kan GPC3-S-Fab nemt blive produceret i periplasm af bakterier på en stor skala.
Bruger den proteinekspression og -oprensning strategi er bes…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev økonomisk støttet af R & D planlægger i Guangdong provinsen (PR Kina) (2016A050503028).
Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
DMEM | Gibco | C11995500CP | |
RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
Glycine | aladdin | A110752-500g | |
KCl | aladdin | P112134-500g | |
MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
25cm2 flask | Corning | 430639 | |
96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
NK92 | ATCC | CRL2408 |