פילוח GPC3 נוגדן Bispecific, GPC3-S-חיובי, עם חזק Cytotoxicity
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר נוגדן bispecific GPC3-S-Fab ב Escherichia coli. GPC3-S-Fab מטוהרים יש cytotoxicity חזק נגד תאי סרטן הכבד חיובי GPC3.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את הבנייה ואת מחקרים פונקציונלי של נוגדן bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs יכול לזהות שתי epitopes שונות דרך שלהם שתי זרועות שונות. bsAbs נחקרו באופן פעיל בשל יכולתן לגייס תאים חיסוניים כדי להרוג תאים סרטניים ישירות. כיום, הרוב המכריע של bsAbs מיוצרים בצורה של חומרים, או כמו bsAbs המכילים Fc או נגזרות bsAb קטן יותר ללא אזור Fc. במחקר זה, GPC3-S-Fab, נוגדן bispecific מבוסס נוגדן פרגמנט (חיובי), תוכנן על-ידי קישור של Fab של נוגדן anti-GPC3 GC33 עם נוגדן anti-CD16 מחשבים בודדת. יכול להיות לידי ביטוי Escherichia coli , מטוהרת על-ידי שני זיקה chromatographies GPC3-S-Fab. GPC3-S-Fab מטוהרים ניתן לאגד, במיוחד להרוג תאים סרטניים בכבד חיובי GPC3 על-ידי גיוס תאים רוצח טבעי, רומז על פוטנציאל היישום של GPC3-S-Fab בטיפול בסרטן הכבד.
Introduction
נוגדנים חד-שבטיים המשמשים כיום בהרחבה עבור סרטן טיפול1. בשל הגמישות של נוגדנים, בפורמטים שונים נוגדן מבוססי נחקרו באופן פעיל. לעומת נוגדנים חד-שבטיים, bsAbs יש שני מודולים איגוד אנטיגן שונים, המאפשרים להם לזהות שתי מטרות שונות בו זמנית וביעילות לעורר הגיוס של תאים חיסוניים אפקטור למטרה ולהרוג תאים סרטניים2.
תבניות bsAb רקומביננטי הנוכחי ניתן להקצות באופן כללי שתי מחלקות: bsAbs המכילים Fc ו- bsAbs ללא אזור Fc. בהשוואה לתבניות Fc המכילים בעיקר המיוצרים בתאי יונקים, bsAbs ללא אזור Fc יש היתרונות בגדלים קטנים יותר, בקלות רבה יותר מיוצרים במערכות ביטוי מיקרואורגניזם, והוא יכול לחדור רקמות הגידול ביעילות רבה יותר 3.
bsAbs ללא אזור Fc נוצרות בדרך כלל על-ידי קישור moieties איגוד בודדים, כגון שברים משתנה יחיד-שרשרת (scFvs) או פאבס3. ללא ייצוב התחומים, bsAbs מבוסס על שברי scFv לעיתים קרובות חשף יציבות תרמית, המסיסות נמוכה או הפוטנציאל מוגברת של צבירת4,5. לעומת זאת, מבוססת-חיובי bsAbs יציבים יותר בשל heterodimerization של CH1 ו- CL ב4,moiety Fab יליד6.
תחום משתנה של נוגדנים כבד שרשרת-בלבד (VHHs, המכונה גם נוגדנים מחשבים בודדת) הם הרסיס אנטיגן מחייב פעיל של נוגדנים טבעיים שרשרת כבדה7. VHHs יש את המאפיינים של זיקה גבוהה, ירידה לפרטים של IgGs המקובלת8, immunogenicity נמוך, תפוקה גבוהה חיידקי הביטוי9. לעומת Fv שברי, VHHs יש יציבות תרמית גבוהה10 לעומת Fab moieties, VHHs יש בגדלים קטנים יותר בשל היעדר CH1 ו- CL. לפיכך, S-Fab, התבנית bsAb שהושגו על-ידי קישור של Fab עם נוגדן מחשבים בודדת, VHH, היה מתוכנן ולמד אפקטים אנטי הגידול שלה,11,12.
במחקר זה, תוארה הקמת GPC3-S-Fab על-ידי קישור של Fab של hGC3313 עם VHH anti-CD16a14 . GPC3-S-Fab יכול להיות מיוצר באופן יעיל על-ידי periplasmic ביטוי Escherichia coli (e. coli). מחקרים פונקציונלי של GPC3-S-Fab הציע כי GPC3-S-Fab היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בסרטן הכבד. לפיכך, היתרונות של GPC3-S-Fab על טכניקות חלופיות בנתונים החלים על מחקרים קודמים כוללים ייצור קל טיהור, ואת bsAbs יציב יותר.
הביטוי יונקים ומערכות ביטוי prokaryotic שימשו כדי לבטא בפורמטים שונים של BsAbs. בניגוד ביטוי בתרבית של מערכות, e. coli-מערכות ביטוי חלבון מבוסס יש יתרונות רבים, כולל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה, חוסך עבודה, להקל על מניפולציות גנטיות ו- יעילות המרה גבוהה15. להבעה bsAbs e. coli, ישנן שתי אסטרטגיות בסיסיות: ביטוי ציטופלזמה, ביטוי periplasm בין ציטופלזמה החיצוני של קרום התא15. לעומת הסביבה תוך צמצום של הציטופלסמה, periplasm הוא סביבה, המקדם את הקיפול הנכון יותר חמצון, שותף ביטוי של חלבונים16. קיפול הנכון ממלא תפקיד מפתח בדור מסיסות, יציבות ותפקוד של bsAbs. לכן, נוספה pelB רצף האות N-הסופית של S-Fab לכוון הפרשת כדי periplasm e. coli17. כדי להבטיח הנכון קיפול, המסיסות, יציבות תרמית, יציבות הסתגלותי, להפחית את המורכבות ואת הגודל של נוגדן הוא לעתים קרובות מועסקים16. התבנית S-Fab מורכב Fab אחד אחד VHH, הבאה לידי ביטוי היטב ככל הנראה בגלל מבנה פשוט של גודל קטן חיידקי מערכות.
GPC3 נבחרה תבנית נוגדן bispecific זו GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) הוא חבר של המשפחה פרוטאוגליקן סולפט (HS) הפארין מעוגנת השטח תא דרך glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 הוא overexpressed ב-70% מהמקרים (HCC) קרצינומה hepatocellular, באיזה חשבון עבור הרוב המכריע של סרטן הכבד19,20,21,22. כי GPC3 מתבטאת לעיתים רחוקות רקמות רגילה, GPC3 הוצע כמטרה פוטנציאלית עבור HCC. MAbs בעכבר מרובים הופקו נגד GPC3. עם זאת, רק GC33 הציג פעילות אנטי הגידול מוגבל 22, והוא נכשל להפגין יעילות קלינית בחולים. במחקר זה, GPC3-S-Fab הוצגה היכולת לגייס תאי NK כדי להרוג תאים סרטניים GPC314.
לגייס תאי NK, שימש VHH אנטי-CD16. CD16a הוא קולטן IgG זיקה נמוכה, באה לידי ביטוי בעיקר על תאים הרוצח הטבעיים (NK), מקרופאגים, ומונוציטים ו תתי כמה סוגים של תאי T. זה מעורב נוגדנים תלויי תא cytotoxicity (ADCC) על ידי תאי NK23. תאי NK אדם יכולים להיות מסווגים לשני סוגים, CD56 – CD16 + ו CD56 + CD16-. בניגוד תאי NK CD56 + CD16−, CD56-תאי NK CD16 + יכול לשחרר רמות גבוהות יותר של perforin granzyme B, ובכך להציג cytotoxicity חזקה של24. תאים Kupffer (kcs ב), לבטא CD16a, הם המקרופאגים תושב בכבד. תאים Kupffer תפקיד חשוב בדיכוי סרטן הכבד25. לפיכך, ייתכן bsAbs מיקוד CD16a אסטרטגיה מבטיח יותר מאשר עיסוק ותאי T כנגד סרטן הכבד.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מציגים אסטרטגיה לבנות פורמט חדש של bsAbs, GPC3-S-Fab, אשר יכול לגייס תאי NK מיקוד תאי גידול חיובי GPC3. S-Fab מבוסס על Fab טבעי תבנית על-ידי הוספת11,VHH anti-CD1612. לעומת אזור Fc המכיל bsAbs, GPC3-S-Fab יכול בקלות להיות מיוצר את periplasm של חיידקים בקנה מידה גדול.
בא…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי R & D תוכנית של בפרובינצית גואנג-דונג (סין) (2016A050503028).
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Pesquisa do Câncer. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161–an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
