एक GPC3-लक्ष्यीकरण Bispecific एंटीबॉडी, GPC3-एस-फैब, शक्तिशाली Cytotoxicity के साथ
Summary
यहां, हम ई कोलाई में एक bispecific एंटीबॉडी GPC3-एस-फैब का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । शुद्ध GPC3-एस फैब GPC3 सकारात्मक जिगर कैंसर की कोशिकाओं के खिलाफ प्रबल cytotoxicity है ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल में एक bispecific एंटीबॉडी (bsAb), GPC3-एस-फैब के निर्माण और कार्यात्मक अध्ययन का वर्णन है । bsAbs अपने दो अलग हथियारों के माध्यम से दो अलग epitopes पहचान सकते हैं । bsAbs सक्रिय रूप से अपने को सीधे प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भर्ती करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को मारने की क्षमता के लिए अध्ययन किया गया है । वर्तमान में, bsAbs के बहुमत रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के रूप में उत्पादित कर रहे हैं, या तो एफसी के रूप में bsAbs युक्त या एफसी क्षेत्र के बिना छोटे bsAb डेरिवेटिव के रूप में । इस अध्ययन में, GPC3-एस-फैब, एक एंटीबॉडी अंश (फैब) आधारित bispecific एंटीबॉडी, एंटी-GPC3 एंटीबॉडी GC33 के फैब को एंटी-CD16 एकल डोमेन एंटीबॉडी के साथ लिंक करके डिज़ाइन किया गया था । GPC3-एस-फैब ई कोलाई में व्यक्त किया जा सकता है और दो अपनत्व chromatographies द्वारा शुद्ध । शुद्ध GPC3-एस-फैब विशेष रूप से करने के लिए और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं की भर्ती द्वारा GPC3 सकारात्मक जिगर कैंसर की कोशिकाओं को मारने के लिए बाध्य कर सकते हैं, जिगर कैंसर थेरेपी में GPC3 एस-फैब के एक संभावित अनुप्रयोग का सुझाव ।
Introduction
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अब मोटे तौर पर कैंसर के इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे है1। एंटीबॉडी के लचीलेपन के कारण विभिन्न एंटीबॉडी आधारित स्वरूपों का सक्रिय रूप से पता लगाया गया है । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ तुलना में, bsAbs दो अलग प्रतिजन बाध्यकारी मॉड्यूल है, उन्हें एक साथ दो विभिन्न लक्ष्यों को पहचानने के लिए सक्षम करने और कुशलतापूर्वक लक्ष्य और ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए प्रतिरक्षा प्रभाव कोशिकाओं की भर्ती को ट्रिगर2.
वर्तमान रिकॉमबिनेंट bsAb स्वरूपों आम तौर पर दो वर्गों को सौंपा जा सकता है: एफसी एक एफसी क्षेत्र के बिना bsAbs और bsAbs युक्त । एफसी के साथ तुलना स्वरूपों कि ज्यादातर स्तनधारी कोशिकाओं में उत्पादित कर रहे हैं, एक एफसी क्षेत्र के बिना bsAbs छोटे आकार के फायदे हैं, और अधिक आसानी से सूक्ष्मजीवों अभिव्यक्ति प्रणालियों में उत्पादित कर रहे हैं, और ट्यूमर के ऊतकों और अधिक कुशलता से प्रवेश कर सकते है 3.
एक एफसी क्षेत्र के बिना bsAbs सामांयतः एकल श्रृंखला चर टुकड़े (scFvs) या Fabs3के रूप में व्यक्तिगत बाध्यकारी moieties, जोड़ने के द्वारा बनाई गई हैं । स्थिर डोमेन के बिना, bsAbs scFv टुकड़े पर आधारित अक्सर थर्मल स्थिरता समझौता किया है, कम घुलनशीलता, या एकत्रीकरण के लिए एक वृद्धि की क्षमता4,5. इसके विपरीत, फैब आधारित bsAbs की heterodimerization के कारण अधिक स्थिर हैं और देशी फैब moiety4,6में CH1 और सीएल है ।
भारी श्रृंखला से चर डोमेन-केवल एंटीबॉडी (VHHs, भी एक डोमेन एंटीबॉडी के रूप में संदर्भित) सक्रिय प्रतिजन-प्राकृतिक भारी श्रृंखला एंटीबॉडी7के टुकड़े बाध्यकारी हैं । VHHs उच्च समानता, पारंपरिक IgGs8, कम immunogenicity की विशिष्टता, और बैक्टीरियल अभिव्यक्ति9में उच्च पैदावार की विशेषताओं है । Fv टुकड़े के साथ तुलना में, VHHs उच्च थर्मल स्थिरता10है । फैब moieties की तुलना में, VHHs में CH1 और सीएल की कमी के कारण छोटे आकार होते हैं । इस प्रकार, एस फैब, bsAb एक डोमेन एंटीबॉडी, VHH के साथ फैब जोड़ने के द्वारा प्राप्त स्वरूप, डिजाइन और इसके विरोधी ट्यूमर प्रभाव11,12के लिए अध्ययन किया गया था ।
इस अध् ययन में GPC3-एस-फैब को hGC3313 के फैब को एक एंटी-CD16a VHH14 के साथ जोडऩे के द्वारा निर्माण का वर्णन किया गया । GPC3-एस-फैब कुशलतापूर्वक ई कोलाई (ई. कोलाई)में periplasmic अभिव्यक्ति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है । GPC3 के कार्यात्मक अध्ययन-एस फैब का सुझाव दिया है कि GPC3-एस-फैब जिगर कैंसर थेरेपी के लिए एक आशाजनक रणनीति है । इस प्रकार, पिछले अध्ययनों के लागू संदर्भों के साथ वैकल्पिक तकनीकों पर GPC3-S-फैब के लाभ आसान उत्पादन और शुद्धि, और अधिक स्थिर bsAbs शामिल हैं ।
BsAbs के विभिन्न स्वरूपों को व्यक्त करने के लिए स्तनधारी एक्सप्रेशन सिस्टम और prokaryotic एक्सप्रेशन सिस्टम का इस्तेमाल किया गया है । स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों के विपरीत, ई. कोलाईआधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों उच्च पैदावार, कम लागत और श्रम की बचत, आनुवंशिक जोड़तोड़ की आसानी, और उच्च परिवर्तन दक्षता15सहित कई लाभ, है । ई. कोलाईमें bsAbs अभिव्यक्ति के लिए, वहां दो बुनियादी रणनीतियों रहे हैं: कोशिका द्रव्य और बाह्य कोशिका झिल्ली15के बीच periplasm में कोशिका द्रव्य और अभिव्यक्ति में अभिव्यक्ति । कोशिका द्रव्य के कम करने के वातावरण की तुलना में, periplasm एक अधिक ऑक्सीकरण वातावरण है, जो सही तह और प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है16. सही तह घुलनशीलता, स्थिरता और bsAbs के समारोह पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, एक संकेत अनुक्रम pelB ई. कोलाई17के periplasm के लिए प्रत्यक्ष स्राव करने के लिए एस-फैब के एन-टर्मिनस के लिए जोड़ा गया था । सही तह, घुलनशीलता, थर्मल स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, और संरचना स्थिरता, जटिलता को कम करने और एक एंटीबॉडी के आकार अक्सर16कार्यरत है । एस फैब प्रारूप एक फैब और एक VHH है, जो बहुत अच्छी तरह से बैक्टीरिया की संभावना सरल संरचना और छोटे आकार के कारण प्रणालियों में व्यक्त की है के होते हैं ।
GPC3 को इस GPC3-एस-फैब bispecific एंटीबॉडी फॉर्मेट में चुना गया था । Glypican-3 (GPC3) हेपरिन सल्फेट (एच एस) proteoglycan परिवार है कि glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई)18के माध्यम से सेल की सतह के लिए लंगर का एक सदस्य है । GPC3 hepatocellular कार्सिनोमा (HCC) मामलों, जो जिगर कैंसर के बहुमत के लिए खाते19,20,21,22के ७०% में व्यक्त की है । क्योंकि GPC3 शायद ही कभी सामांय ऊतकों में व्यक्त की है, GPC3 HCC के लिए एक संभावित लक्ष्य के रूप में प्रस्तावित किया गया है । एकाधिक माउस mAbs GPC3 के खिलाफ उत्पादन किया गया है । हालांकि, केवल GC33 सीमित विरोधी ट्यूमर गतिविधि का प्रदर्शन 22, और यह रोगियों में नैदानिक प्रभावकारिता प्रदर्शित करने में विफल । इस अध्ययन में, GPC3-एस-फैब को NK कोशिकाओं को GPC3 ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए भर्ती करने में सक्षम दिखाया गया था14.
NK कोशिकाओं की भर्ती के लिए एंटी CD16 VHH का इस्तेमाल किया गया । CD16a एक कम समानता आईजीजी रिसेप्टर, प्राकृतिक हत्यारा पर मुख्य रूप से व्यक्त (NK) कोशिकाओं, मैक्रोफेज, monocytes और टी कोशिकाओं के कुछ उपप्रकार है. यह एंटीबॉडी-निर्भर सेल cytotoxicity (ADCC) में शामिल है NK कोशिकाओं द्वारा23। मानव NK कोशिकाओं को दो प्रकार से वर्गीकृत किया जा सकता है, CD56-CD16 + और CD56 + CD16-. CD56 + CD16 − NK कोशिकाओं के विपरीत, CD56-CD16 + NK कोशिकाओं perforin और granzyme बी के उच्च स्तर जारी कर सकते हैं और इस तरह एक मजबूत cytotoxicity24मौजूद हैं । Kupffer कोशिकाओं (केसीएस), व्यक्त CD16a, जिगर में निवासी मैक्रोफेज हैं. Kupffer कोशिकाओं जिगर कैंसर25के दमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस प्रकार, bsAbs लक्ष्यीकरण CD16a जिगर कैंसर के खिलाफ टी कोशिकाओं उलझाने से एक अधिक आशाजनक रणनीति हो सकती है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम bsAbs, GPC3-एस-फैब, जो NK कोशिकाओं GPC3 सकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं लक्ष्यीकरण की भर्ती कर सकते है के एक नए स्वरूप का निर्माण करने के लिए एक रणनीति पेश करते हैं । एस फैब एक विरोधी CD16 VHH11,<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम गुआंग्डोंग प्रांत (पीआर चाइना) (2016A050503028) के अनुसंधान एवं विकास योजना द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित था ।
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
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