여기, 우리 제시에 bispecific 항 체 GPC3-S-팹 생산 프로토콜 대장균. 순화 GPC3-S-팹 GPC3 긍정적인 간 암 세포에 대 한 강력한 세포 독성을 있다.
이 프로토콜 건설과 bispecific 항 체 (bsAb), GPC3-S-팹의 기능 연구에 설명합니다. bsAbs는 그들의 두 개의 서로 다른 무기를 통해 두 개의 다른 epitopes를 인식할 수 있습니다. bsAbs는 직접 종양 세포를 죽 일 면역 세포를 보충 하는 그들의 기능에 대 한 적극적으로 연구 되었습니다. 현재, bsAbs의 대부분은 재조합 단백질, Fc 포함 된 bsAbs 또는 Fc 지역 없이 작은 bsAb 파생 상품의 형태로 생산 됩니다. 이 연구에서는 GPC3-S-팹, 항 체 단편 (팹) 기반된 bispecific 항 체, 안티-GPC3 항 체 GC33 안티 CD16 단일 도메인 항 체의 Fab을 연결 하 여 설계 되었다. GPC3-S-팹 대장균 에 표현 고 두 선호도 chromatographies에 의해 순화 될 수 있습니다. 순화 GPC3-S-팹 구체적으로 바인딩할 하 고 세포를 죽 일 GPC3 긍정적인 간 암 자연 킬러 세포를 모집 하 여 간 암 치료에 GPC3-S-팹의 잠재적인 응용 프로그램을 제안 수 있습니다.
단일 클론 항 체는 이제 암 치료1광범위 하 게 사용 된다. 항 체의 유연성으로 인해 다양 한 항 체 기반 형식을 적극적으로 탐험 있다. 단일 클론 항 체와 비교, bsAbs 두 개의 다른 항 원 바인딩 모듈, 2 개의 다른 목표 동시에 고 효율적으로 방 아 쇠를 목표 하 고 종양 세포2를 죽 일 면역 효과 기 세포의 채용을 인식 하는.
현재 재조합 bsAb 형식을 일반적으로 두 개의 클래스에 할당할 수 있습니다: bsAbs 포함 하는 Fc와 Fc 지역 없이 bsAbs. 대부분 포유류 세포에서 생성 되는 Fc 포함 된 형식에 비해, bsAbs Fc 지구는 작은 크기의 장점을 하지 않고 더 쉽게 미생물 식 시스템에서 생산 되 고 보다 효율적으로 종양 조직에 침투 수 있습니다 3.
bsAbs Fc 지역 없이 일반적으로 개별 바인딩 moieties 단일 체인 변수 조각 (scFvs) 또는 팹3등을 연결 하 여 형성 된다. 안정적인 도메인 없이 bsAbs 자주 scFv 조각에 따라 열 안정성, 낮은 용 해도, 또는 집계4,5에 대 한 증가 잠재력 손상 있다. 반면, bsAbs 팹 기반 네이티브 팹 moiety4,6CH1 및 CL의 heterodimerization 때문에 안정 되어 있다.
무거운-체인 전용 항 체 (VHHs, 단일 도메인 항 체로 라고도 함)에서 변수 도메인은 자연 무거운 체인 항 체7의 활성 항 원 바인딩 조각. VHHs에 있는 높은 선호도의 특성, 기존의 IgGs8, 낮은 immunogenicity 및 높은 수익률의 특이성 세균성 식9. Fv 조각에 비해, VHHs 높은 열 안정성10있다. 팹 moieties와 비교해, VHHs는 CH1 및 CL의 부족으로 인해 작은 크기. 따라서, S-팹, 단일 도메인 항 체, VHH와 팹을 연결 하 여 얻은 bsAb 형식 설계 하 고 그것의 항 종양 효과11,12에 대 한 공부.
이 연구에서는 hGC3313 안티 CD16a VHH14 의 팹을 연결 하 여 GPC3-S-팹 건설은 설명 했다. GPC3-S-팹 periplasmic 식 대장균 (대장균)에 효율적으로 제작 될 수 있습니다. GPC3-S-팹의 기능 연구 GPC3-S-팹은 간 암 치료를 위한 유망한 전략 제안. 따라서, 쉽게 생산 및 정화, 그리고 안정 되어 있는 bsAbs는 이전 연구에 대 한 해당 참조를 대체 기술을 통해 GPC3-S-팹의 장점이 있습니다.
포유류 식 시스템 및 간결한 식 시스템 BsAbs의 다양 한 포맷을 표현 하기 위해 사용 되었습니다. 포유류 식 시스템, 대장균과 달리-기반된 단백질 식 시스템은 높은 수율, 낮은 비용과 노동 절약, 유전자 조작, 높은 변환 효율15의 용이성을 포함 하 여 많은 혜택. 대장균에서 bsAbs 식에 대 한 두 가지 기본 전략: 세포질과 세포질 사이 세포 막 외부15periplasm에 식 식. 세포질의 감소 환경에 비해는 periplasm 더 산화 환경, 올바른 접는 촉진 및 단백질16의 공동 식 이다. 올바른 접는 bsAbs의 용 해도, 안정성과 기능 생성에 주요 역할을 하고있다. 따라서, 신호 순서 pelB 대장균17는 periplasm에 분 비를 직접 S 팹의 N-말단에 추가 되었습니다. 되도록 정확한 접는, 용 해도, 열 안정성 및 구조적 안정성, 복잡성 및 항 체의 크기 감소는 자주 고용16. 한 팹과 세균성 시스템 가능성이 간단한 구조와 작은 크기 때문에 아주 잘 표현 한 VHH S 팹 형식에 의하여 이루어져 있다.
GPC3은 GPC3-S-팹 bispecific 항 체 형식으로 선정 되었다. Glypican-3 (GPC3) glycosylphosphatidylinositol (GPI)18을 통해 세포 표면에 고정 되는 헤 파 린 황산 염 (HS) proteoglycan 가족의 구성원입니다. GPC3 70%의 간세포 암 (HCC) 경우, 간 암19,20,,2122의 대부분에 대 한 어떤 계정에 overexpressed입니다. GPC3는 정상 조직에 거의 표현 된다, 때문에 GPC3 HCC에 대 한 잠재적인 대상으로 제안 하고있다. 여러 마우스 mAbs GPC3에 대 한 제작 되었습니다. 그러나,만 GC33 전시 제한 안티 종양 활동 22, 그리고 환자에서 임상 효능을 전시 하는 데 실패. 이 연구에서는 GPC3-S-팹 모집 GPC3 종양 세포14를 죽 일 NK 세포 수를 표시 했다.
NK 세포를 모집, 안티 CD16 VHH 사용 되었다. CD16a 낮은 친 화력 IgG 수용 체, T 세포의 일부 하위, monocytes, 대 식 세포, 자연 킬러 (NK) 세포에 주로 표현 이다. 그것은 항 체 의존 세포 세포 독성 (ADCC) NK 세포23에 의해 포함 된다. 인간 NK 세포 CD56 두 종류로 분류 될 수 있다-CD16 +, CD56 + CD16-. 달리 CD56 + CD16− NK 세포, CD56-CD16 + NK 세포 수 perforin와 granzyme B 놓고 따라서 강한 세포 독성24제시. Kupffer 세포 (관세), CD16a, 표현 간에서 상주 대 식 세포는. Kupffer 세포 간 암25의 억제에 중요 한 역할을 한다. 따라서, bsAbs CD16a를 대상으로 T 세포 간 암에 대 한 매력 보다는 더 유망한 전략을 수 있습니다.
이 연구에서는 bsAbs의 새로운 형식을 구성 하는 전략 소개 GPC3 긍정적인 종양 세포를 대상으로 하는 NK 세포를 모집 할 수 있는 GPC3-S-팹. S-팹 자연 팹 기반 안티 CD16 VHH11,12를 추가 하 여 형식. BsAbs 포함 된 Fc 지역에 비해, GPC3-S-팹 쉽게 생산 수 있습니다 큰 규모에 박테리아의 periplasm에서.
프로토콜에 설명 된 식과 정화 전략을 사용 하 …
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 R & D 계획의 광 동성 (중국 홍보) (2016A050503028)에 의해 재정적으로 지원 되었다.
Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
DMEM | Gibco | C11995500CP | |
RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
Glycine | aladdin | A110752-500g | |
KCl | aladdin | P112134-500g | |
MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
25cm2 flask | Corning | 430639 | |
96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
NK92 | ATCC | CRL2408 |