Her presenterer vi en protokoll for å produsere en bispecific antistoff GPC3-S-Fab Escherichia coli. Det rensede GPC3-S-Fab har potente cytotoksisitet mot GPC3 positive lever kreftceller.
Denne protokollen beskriver konstruksjon og funksjonelle studier av et bispecific antistoff (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs gjenkjenner to forskjellige epitopes gjennom sine to forskjellige våpen. bsAbs har vært aktivt undersøkt for sin evne til å rekruttere direkte immunceller å drepe kreftceller. Fleste bsAbs er, produsert i form av rekombinante proteiner, enten som Fc inneholder bsAbs eller mindre bsAb derivater uten regionen Fc. I denne studien, ble GPC3-S-Fab, et antistoff fragment (Fab) basert bispecific antistoff, utviklet ved å koble Fab anti-GPC3 antistoff GC33 med et anti-CD16 enkelt domene antistoff. GPC3-S-Fab kan uttrykkes i Escherichia coli og renset ved to affinitet chromatographies. Det rensede GPC3-S-Fab kan spesielt binde til og drepe GPC3 positive leveren kreftceller ved rekruttering naturlige drepe celler, antyder en mulig anvendelse av GPC3-S-Fab i leveren kreft terapi.
Monoklonale antistoffer er nå bredt brukt for kreft behandling1. På grunn av fleksibiliteten av antistoffer, har ulike antistoff-baserte formater vært aktivt utforsket. Sammenlignet med monoklonale antistoffer, har bsAbs to forskjellige antigen bindende moduler, slik at de gjenkjenner to forskjellige mål samtidig og effektivt utløse rekruttering av immun Effektor celler til målet og drepe tumor celler2.
Gjeldende rekombinant bsAb formater kan tildeles generelt til to klasser: Fc inneholder bsAbs og bsAbs uten en Fc-regionen. Sammenlignet med Fc inneholder formater som produseres hovedsakelig i pattedyrceller, bsAbs uten en Fc-regionen har fordeler i mindre størrelser, produseres lettere i microorganism uttrykk systemer og kan trenge tumor vev mer effektivt 3.
bsAbs uten en Fc-regionen er vanligvis dannet ved å knytte individuelle bindende moieties, som enkelt-kjeden variabel fragmenter (scFvs) eller produksjonslokaler både3. Uten de stabiliserende domenene, har bsAbs basert på scFv fragmenter ofte kompromittert termisk stabilitet, lav oppløselighet eller en økt potensialet for aggregering4,5. Fab-baserte bsAbs er mer stabil på grunn av heterodimerization av CH1 og CL i native Fab moiety4,6.
Variabel domene fra heavy-kjede-bare antistoffer (VHHs, også referert til som enkelt domene antistoffer) er aktive antigen bindende fragmentet av naturlig tunge kjeden antistoffer7. VHHs har egenskapene til høy affinitet, spesifisitet av konvensjonelle IgGs8, lav immunogenisitet og høy avkastning i bakteriell uttrykk9. VHHs sammenlignet med sluttverdi fragmenter, og har høyere temperaturstabilitet10. Sammenlignet med Fab moieties, har VHHs mindre størrelser på grunn av manglende CH1 og CL. Dermed ble S-Fab, bsAb format ved å knytte Fab med et enkelt domene antistoff, VHH, designet og studert for sine anti-svulst effekter11,12.
I denne studien ble byggingen av GPC3-S-Fab ved å koble Fab hGC3313 med en anti-CD16a VHH14 beskrevet. GPC3-S-Fab kan effektivt produseres av periplasmic uttrykk i Escherichia coli (E. coli). Funksjonell studier av GPC3-S-Fab antydet at GPC3-S-Fab en lovende strategi for leveren kreft terapi. Dermed inkluderer fordelene med GPC3-S-Fab over alternative teknikker med gjeldende referanser til tidligere undersøkelser enkel produksjon og rensing og mer stabil bsAbs.
Pattedyr uttrykk systemer og prokaryote uttrykk systemer har blitt brukt til å uttrykke ulike formater av BsAbs. I motsetning til pattedyr uttrykk systemer, E. coli-basert protein uttrykk systemer har mange fordeler, inkludert høy avkastning, lave kostnader og arbeidsbesparende, enkel genetisk manipulasjon, og høy transformasjon effektivitet15. BsAbs uttrykk i E. coli, er det to grunnleggende strategier: uttrykk i cytoplasma og uttrykk i periplasm mellom cytoplasma og ytre cellemembraner15. Sammenlignet med å redusere miljøet i cytoplasma, er periplasm en mer oksiderende miljø, som fremmer den riktige folding og co uttrykk proteiner16. Riktig folding spiller en nøkkelrolle i løselighet, stabilitet og funksjonen generasjon av bsAbs. Derfor ble et signal sekvens pelB lagt til N-terminus av S-Fab til direkte sekresjon til periplasm E. coli17. For å sikre ansatt riktig folding, løselighet, termisk stabilitet og conformational stabilitet, redusere kompleksiteten og størrelsen på et antistoff er ofte16. S-Fab formatet består av en Fab og en VHH, som er godt uttrykt i bakteriell systemer sannsynligvis på grunn av enkel struktur og liten størrelse.
GPC3 ble valgt i denne GPC3-S-Fab bispecific antistoff format. Glypican-3 (GPC3) er medlem av heparin sulfate (HS) proteoglycan familien som er forankret til celleoverflaten gjennom glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 er overexpressed i 70% av hepatocellulært karsinom (HCC) tilfeller som utgjør flertallet av leveren kreft19,20,21,22. Fordi GPC3 er sjelden uttrykt i normalt vev, foreslått GPC3 som et mulig mål for HCC. Flere musen mAbs har vært produsert mot GPC3. Imidlertid bare GC33 viste begrenset anti-svulst aktivitet 22, og den ikke viser klinisk effekt hos pasienter. I denne studien, ble GPC3-S-Fab vist å rekruttere NK celler å drepe GPC3 tumor celler14.
For å rekruttere NK celler, ble anti-CD16 VHH brukt. CD16a er en lav affinitet IgG reseptor, hovedsakelig på naturlige killer (NK) celler, makrofager, monocytter og noen undertyper av T-celler. Det er involvert i antistoff-avhengig celle cytotoksisitet (ADCC) av NK celler23. Menneskelige NK celler kan kategoriseres i to typer, CD56 – CD16 + og CD56 + CD16-. I motsetning til CD56 + CD16− NK celler, CD56-CD16 + NK celler kan gi høyere nivåer av perforin og granzyme B og dermed presentere en sterk cytotoksisitet24. Kupffer celler (KCs), uttrykke CD16a, er de fastboende makrofagene i leveren. Kupffer celler spiller en viktig rolle i undertrykkelse av leverkreft25. Dermed kan bsAbs målretting CD16a være en mer lovende strategi enn vinnende T-celler mot leverkreft.
I denne studien presenterer vi en strategi for å bygge et nytt format for bsAbs, GPC3-S-Fab, som kan rekruttere Celler NK målretting GPC3 positive kreftceller. S-Fab er basert på det naturlige Fab format ved å legge til en anti-CD16 VHH11,12. Sammenlignet med bsAbs med Fc regionen, kan GPC3-S-Fab lett bli produsert i periplasm av bakterier i stor skala.
Bruke uttrykk og rensing strategi beskrevet i protokollen, fikk vi en løselig …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av R & D Plan av Guangdongprovinsen (PR Kina) (2016A050503028).
Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
DMEM | Gibco | C11995500CP | |
RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
Glycine | aladdin | A110752-500g | |
KCl | aladdin | P112134-500g | |
MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
25cm2 flask | Corning | 430639 | |
96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
NK92 | ATCC | CRL2408 |