Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um anticorpo bispecific GPC3-S-Fab em Escherichia coli. O GPC3-S-Fab purificado tem potente citotoxicidade contra células de câncer de fígado positivo GPC3.
Abstract
Este protocolo descreve a construção e estudos funcionais de um anticorpo bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs pode reconhecer dois diferentes epitopos através de suas duas armas diferentes. bsAbs têm sido estudados ativamente por sua capacidade de recrutar diretamente as células imunes para matar células tumorais. Atualmente, a maioria dos bsAbs é produzida na forma de proteínas recombinantes, quer como bsAbs Fc-contendo derivados de bsAb menores sem região Fc. Neste estudo, GPC3-S-Fab, um anticorpo de bispecific com base de anticorpo fragmento (Fab), foi projetado, vinculando o Fab do anticorpo anti-GPC3 GC33 com anticorpos anti-CD16 único domínio. O GPC3-S-Fab pode ser expressa em Escherichia coli e purificado por duas cromatografias de afinidade. O purificado GPC3-S-Fab especificamente pode vincular a e matar células de câncer de fígado positivo GPC3 através do recrutamento de células de assassinas naturais, sugerindo uma potencial aplicação de GPC3-S-Fab na terapia do câncer de fígado.
Introduction
Os anticorpos monoclonais são agora amplamente utilizados para tratamento de câncer1. Devido à flexibilidade dos anticorpos, vários formatos baseados em anticorpos têm sido ativamente explorados. Comparado com anticorpos monoclonais, bsAbs ter dois módulos de ligação diferente do antígeno, permitindo-lhes a reconhecer dois alvos diferentes simultaneamente e de forma eficiente acionar o recrutamento de células imunes efetoras para alvejar e matar células de tumor2.
Formatos de recombinantes bsAb atual podem ser geralmente atribuídos a duas classes: Fc-contendo bsAbs e bsAbs sem uma região de Fc. Comparado com formatos Fc-contendo principalmente produzidos em células de mamíferos, bsAbs sem uma região Fc tem as vantagens de tamanhos menores, mais facilmente são produzidos em sistemas de expressão de microorganismo e podem penetrar em tecidos de tumor mais eficientemente 3.
bsAbs sem uma região de Fc são formados comumente vinculando metades de vinculação individual, como fragmentos de variável de cadeia única (scFvs) ou Fabs3. Sem os domínios de estabilização, bsAbs com base em fragmentos scFv frequentemente ter comprometido a estabilidade térmica, baixa solubilidade ou um aumento potencial de agregação de4,5. Em contraste, bsAbs baseada na Fab são mais estáveis devido a heterodimerization do CH1 e CL no nativo moiety Fab4,6.
Domínio variável da cadeia pesada-somente anticorpos (VHHs, também conhecidos como anticorpos único domínio) são o ativo fragmento de antígeno-ligando da cadeia pesada natural anticorpos7. VHHs tem as características de alta afinidade, especificidade de convencional IgGs8, baixa imunogenicidade e rendimentos elevados em expressão bacteriana9. Comparado com fragmentos de Fv, VHHs ter maior estabilidade térmica10. Comparado com Fab metades, VHHs têm tamanhos menores devido à falta de CH1 e CL. Assim, S-Fab, o formato de bsAb obtido, vinculando o Fab com um anticorpo de domínio único, VHH, foi concebido e estudado por seus efeitos anti-tumorais11,12.
Neste estudo, foi descrita a construção de GPC3-S-Fab, vinculando o Fab de hGC3313 com um anti-CD16a VHH14 . O GPC3-S-Fab pode ser eficientemente produzido por periplasmático expressão em Escherichia coli (e. coli). Estudos funcionais de GPC3-S-Fab sugeriram que GPC3-S-Fab é uma estratégia promissora para a terapia do câncer de fígado. Assim, as vantagens do GPC3-S-Fab em técnicas alternativas com referências aplicáveis aos estudos anteriores incluem fácil produção e purificação e bsAbs mais estável.
Sistemas de expressão de mamíferos e expressão procarióticas têm sido utilizadas para expressar vários formatos de BsAbs. Em contraste com sistemas de expressão dos mamíferos, e. coli-sistemas de expressão de proteínas com base tem muitos benefícios, incluindo rendimentos elevados, baixo custos e labor-saving, a facilidade de manipulações genéticas e transformação de alta eficiência15. Para bsAbs expressão em e. coli, existem duas estratégias básicas: expressão no citoplasma e expressão no periplasm entre o citoplasma e membranas externas de célula15. Em comparação com o ambiente redutor do citoplasma, o periplasm é um oxidante mais ambiente, que promove o dobramento correto e co expressão de proteínas16. Dobramento correto desempenha um papel fundamental na geração de solubilidade, estabilidade e função de bsAbs. Portanto, um sinal sequência pelB foi adicionado para o N-terminal do Fab-S para dirigir a secreção para o periplasm de Escherichia coli17. Para garantir a correta de dobramento, solubilidade, estabilidade térmica e estabilidade conformacional, reduzindo a complexidade e o tamanho de um anticorpo é frequentemente empregado16. O formato S-Fab consiste de um fabuloso e um VHH, que se expressa muito bem em sistemas bacterianos prováveis devido à estrutura simples e pequeno tamanho.
GPC3 foi escolhido neste formato de anticorpo bispecific GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) é um membro da família de proteoglicano de sulfato (HS) heparina que é ancorado à superfície da célula através de de glicosilfostidilinosiol (GPI)18. GPC3 é Blumental em 70% dos casos de carcinoma (HCC) hepatocelular, que representam a maioria dos cânceres de fígado19,20,21,22. Porque GPC3 raramente é expressa em tecidos normais, GPC3 tem sido proposto como um alvo potencial para HCC. Múltiplos do mouse mAbs foram produzidos contra GPC3. No entanto, apenas GC33 exibiu limitada atividade anti-tumoral 22, e que não apresentam eficácia clínica em pacientes. Neste estudo, GPC3-S-Fab foi mostrado para ser capaz de recrutar células NK para matar de células de tumor GPC314.
Para recrutar células NK, anti-CD16 VHH foi usado. CD16a é um receptor de IgG de baixa afinidade, expressado principalmente em células assassinas naturais (NK), macrófagos, monócitos e alguns subtipos de células T. Está envolvido na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) por NK células23. Células NK humanas podem ser classificadas em dois tipos, CD56 – CD16 + e CD56 + CD16-. Em contraste com as células NK CD56 + CD16−, CD56-células CD16 + NK podem liberar os níveis mais elevados de perforina e granzime B e, portanto, apresentar uma forte citotoxicidade24. Células de Kupffer (KCs), expressando a CD16a, são os macrófagos residentes no fígado. Células de Kupffer desempenham um papel importante na supressão de câncer de fígado,25. Assim, bsAbs segmentação CD16a pode ser uma estratégia mais promissora do que enfrentar as células T contra câncer de fígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, apresentamos uma estratégia para construir um novo formato de bsAbs, GPC3-S-Fab, que pode recrutar células NK como alvo as células de tumor positivo GPC3. O S-Fab baseia-se a Fab natural formato adicionando um anti-CD16 VHH11,12. Comparado com a região de Fc contendo bsAbs, GPC3-S-Fab pode ser facilmente produzida no periplasm de bactérias em grande escala.
Usando a estratégia de expressão e purificação descrita …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela R & D plano da província de Guangdong (China PR) (2016A050503028).
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Pesquisa do Câncer. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161–an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
