GPC3-ориентация Bispecific антител, GPC3-S-Fab, с мощным цитотоксичности
Summary
Здесь мы представляем протокол производить антитела bispecific GPC3-S-Fab в Escherichia coli. Очищенный GPC3-S-Fab имеет мощный цитотоксичность против GPC3 положительные печени раковых клеток.
Abstract
Этот протокол описывает строительные и функциональных исследований bispecific антитела (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs может признать два различных эпитопов через двух различных оружие. bsAbs активно были изучены для их способности непосредственно набирать иммунные клетки, чтобы убить раковые клетки. В настоящее время большинство bsAbs выпускаются в виде рекомбинантных белков, либо как Fc содержащих bsAbs или меньше bsAb производные без ФК региона. В этом исследовании GPC3-S-Fab, антитела фрагмент (ФАБ) на основе bispecific антитела, был разработан путем увязывания Fab антитела анти GPC3 GC33 с одного домена антитела анти CD16. GPC3-S-Fab может выражена в Escherichia coli и очищенный два сродства chromatographies. Очищенный GPC3-S-Fab специально можно привязать к и убить GPC3 позитивные печени раковые клетки путем найма естественных клеток-киллеров, предлагая потенциальным применение GPC3-S-Fab в терапии рака печени.
Introduction
Моноклональные антитела широко используются для лечения рака1. Благодаря гибкости антител активно изучаются различные форматы, основанные на антитела. По сравнению с моноклональными антителами, bsAbs имеют два различных антигена привязки модулей, позволяя им признать, что два различных целей одновременно и эффективно инициировать набор иммунных эффекторных клеток и убить опухолевые клетки2.
Текущие форматы рекомбинантных bsAb могут присваиваться как правило два класса: Fc содержащих bsAbs и bsAbs без ФК региона. По сравнению с Fc содержащих форматы, которые производятся в основном в mammalian клетках, bsAbs без ФК региона имеют преимущества небольших размеров, более легко производятся в системах выражения микроорганизмов и может проникать в ткани опухоли более эффективно 3.
bsAbs без ФК региона часто образуются путем увязывания постановление отдельные привязки, например переменной фрагменты одной цепи (scFvs) или Fabs3. Без стабилизации доменов bsAbs, часто основанные на фрагменты scFv подорвали термическая стабильность, низкая растворимость или увеличение потенциала для агрегирования4,5. В отличие от этого на основе Fab bsAbs более стабильными вследствие heterodimerization CH1 и CL в родной Fab остаток4,6.
Переменной домена от тяжелых цепи только-антител (VHHs, также упоминается как одного домена антитела) являются активные антиген связывая фрагмент природных тяжелых цепей антитела7. VHHs имеют характеристики высоким сродством, специфика обычных IgGs8, низкой иммуногенностью и высокие урожаи в бактериальных выражение9. По сравнению с Fv фрагментов, VHHs имеют более высокой термостабильности10. По сравнению с Fab постановление, VHHs имеют меньшие размеры из-за отсутствия CH1 и CL. Таким образом S-Fab, формат bsAb, полученные путем увязывания Fab с одного домена антитела, VHH, был разработан и изучал его противоопухолевый эффекты11,12.
В этом исследовании был описан строительство GPC3-S-Fab, связывая Fab hGC3313 с анти CD16a VHH14 . GPC3-S-Fab может производиться эффективно периплазматическое выражением в Escherichia coli (E. coli). Функциональные исследования GPC3-S-Fab предложил, что GPC3-S-Fab является перспективной стратегией для терапии рака печени. Таким образом преимущества GPC3-S-Fab альтернативные методы с применимыми ссылки на предыдущие исследования включают в себя легко производства и очистки и более стабильной bsAbs.
Млекопитающих выражение и прокариот выражение систем использовались для выражения различных форматов BsAbs. В отличие от системы млекопитающих выражения, E. coli-системах выражения протеина на основе имеют много преимуществ, включая высокие урожаи, низкой стоимости и труда, экономии, легкость генетических манипуляций и высокие преобразования эффективности15. Для выражения bsAbs в E. coli, существуют две основные стратегии: выражение в цитоплазме и выражение в periplasm между цитоплазмой и наружной мембраны клеток15. По сравнению с снижение окружающей среды цитоплазмы, periplasm является более окисляющие окружающей среды, которая способствует правильной складывания и Сопредседатель выражение белки16. Правильно складывать играет ключевую роль в растворимости, стабильности и функции поколения bsAbs. Таким образом pelB последовательность сигнала был добавлен к N-го S-Fab направлять секреции periplasm E. coli17. Для обеспечения корректного складные, растворимость, термостабильность и конформационную стабильность, уменьшение сложности и размеров антитела часто работают16. S-Fab формата состоит из одного ВСБ и один VHH, который очень хорошо выражена в бактериальных систем, вероятно, из-за простую структуру и малый размер.
GPC3 был выбран в этом формате антитела bispecific GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) является членом семьи протеогликана сульфат (HS) гепарина, которая привязана к поверхности клетки через glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 является гиперэкспрессия в 70% случаев гепатоцеллюлярной карциномой (HCC) случаи, которые составляют большинство из печени рака19,20,,21–22. Потому что редко GPC3 выражается в нормальных тканях, GPC3 было предложено как потенциальной мишенью для КЦУК. Были произведены несколько мышь mAbs против GPC3. Однако только GC33 выставлены ограниченное противоопухолевую активность 22, и он не выставлять клиническая эффективность у пациентов. В этом исследовании чтобы иметь возможность нанимать НК-клеток, чтобы убить GPC3 опухолевых клеток14было показано GPC3-S-Fab.
Чтобы набрать НК-клеток, VHH анти CD16 был использован. CD16a является низкое сродство IgG рецепторов, выражена главным образом на естественных киллеров (НК), макрофаги, моноцитов и некоторых подтипов Т-клеток. Он участвует в цитотоксичности антител зависимой ячейки (ADCC) НК клеток23. NK клеток человека могут быть разделены на два типа, CD56 – CD16 + и CD56 + CD16-. В отличие от CD56 + CD16− НК-клеток, CD56-CD16 + НК-клеток может выпуска более высокого уровня Перфорины и Гранзим B и таким образом представляют сильную цитотоксичность24. Купфера (КИС), выражая CD16a, являются резидентов макрофаги в печени. Купфера играют важную роль в борьбе с раком печени25. Таким образом bsAbs ориентации CD16a может быть более перспективной стратегией, чем привлечение Т-клетки против рака печени.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы представляем стратегию построить новый формат bsAbs, GPC3-S-Fab, который можно набрать НК-клеток, ориентация GPC3 позитивных опухолевых клеток. S-Fab основывается на природных Fab формат, добавив анти CD16 VHH11,12. По сравнению с областью, содержащей…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана R & D плана провинции Гуандун (Китай) (2016A050503028).
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Pesquisa do Câncer. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161–an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
