En GPC3-inriktning Bispecific antikropp, GPC3-S-Fab, med potenta cytotoxicitet
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera en bispecific antikropp GPC3-S-Fab i Escherichia coli. Den renade GPC3-S-Fab har potent cytotoxicitet mot GPC3 positiva levercancer celler.
Abstract
Det här protokollet beskriver konstruktion och funktionella studier av en bispecific antikropp (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs kan känna igen två olika epitoper genom sina två olika vapen. bsAbs har aktivt undersökts för sin förmåga att rekrytera direkt immunceller för att döda tumörceller. För närvarande produceras majoriteten av bsAbs i form av rekombinanta proteiner, antingen som Fc-innehållande bsAbs eller mindre bsAb derivat utan regionen Fc. I denna studie ritades GPC3-S-Fab, en antikropp fragment (Fab) baserat bispecific antikropp, av länka Fab av anti-GPC3 antikropp GC33 med en anti-CD16 enda domän antikropp. GPC3-S-Fab kan vara uttryckt i Escherichia coli och renas genom två affinitet chromatographies. Renat GPC3-S-Fab kan specifikt binda till och döda GPC3 positiva levercancer celler genom rekrytering av naturliga mördarceller, vilket tyder på en potentiell tillämpning av GPC3-S-Fab i levercancer terapi.
Introduction
Monoklonala antikroppar används nu i stort sett för cancer behandling1. På grund av flexibiliteten av antikroppar, har olika antikroppsbaserade format varit aktivt utforskat. BsAbs jämfört med monoklonala antikroppar, och har två olika antigen bindande moduler, så att de kan känna igen två olika mål samtidigt och effektivt utlösa rekrytering av immun effektor celler att rikta och döda tumör celler2.
Nuvarande rekombinant bsAb format allmänhet kan tilldelas till två klasser: Fc-innehållande bsAbs och bsAbs utan ett Fc-regionen. Jämfört med Fc-innehållande format som främst produceras i däggdjursceller, bsAbs utan ett Fc-regionen har fördelarna med mindre storlekar, lättare produceras i mikroorganism uttryck system, och kan tränga igenom tumörvävnad effektivare 3.
bsAbs utan ett Fc-regionen bildas vanligen genom att länka individuella bindande delarna, såsom enda-kedjan variabel fragment (scFvs) eller fjäll3. Utan de stabiliserande domänerna, har bsAbs baserat på scFv fragment ofta komprometterat termisk stabilitet, låga löslighet eller en ökad potential för aggregering4,5. Fab-baserade bsAbs är det däremot mer stabil på grund av heterodimerization av CH1 och CL i native Fab biexponentiellt4,6.
Variabla domänen från heavy-kedja-bara antikroppar (VHHs, också benämnd som enda domän antikroppar) är den aktiva antigen-bindande fragmentet av naturliga tung kedja antikroppar7. VHHs har hög affinitet egenskaper, specificitet av konventionella IgG8, låg immunogenicitet och hög avkastning i bakteriell uttryck9. VHHs jämfört med Fv fragment, och har högre termisk stabilitet10. VHHs jämfört med Fab beståndsdelarna, och har mindre storlekar på grund av CH1 och CL. Således, S-Fab, bsAb formatet erhålls genom att länka Fab med en enda domän antikropp, VHH, ritades och studerade för dess anti-tumör effekt11,12.
I denna studie beskrevs byggandet av GPC3-S-Fab genom att länka Fab hGC3313 med en anti-CD16a VHH14 . GPC3-S-Fab kan produceras effektivt av periplasmic uttryck i Escherichia coli (E. coli). Funktionella studier av GPC3-S-Fab föreslog att GPC3-S-Fab är en lovande strategi för levercancer terapi. GPC3-S-Fab fördelar jämfört med alternativa tekniker med tillämpliga hänvisningar till tidigare studier inkluderar således lätt produktion, rening och stabilare bsAbs.
Däggdjur uttryck och prokaryota uttryck system har använts för att uttrycka olika format av BsAbs. Till skillnad från däggdjur uttryck system, E. coli-baserade protein uttryck system har många fördelar, bland annat hög avkastning, låg kostnad och arbetsbesparande, förenklar genetiska manipulationer, och hög förvandling effektivitet15. För bsAbs uttryck i E. coli, finns det två grundläggande strategier: uttryck i cytoplasman och uttryck i periplasm mellan cytoplasman och yttre cellmembran15. Periplasm jämfört med reducerande miljö av cytoplasman, och är en mer oxiderande miljö som främjar den rätta vikningen och samtidig uttryck för proteiner16. Rätt fällbara spelar en nyckelroll i löslighet, stabilitet och funktion generation av bsAbs. Därför lades en signal sekvens pelB till N-terminalen av S-Fab direkt utsöndring till periplasm av E. coli17. För att säkerställa anställda korrekt vikning, löslighet, termisk stabilitet och konfirmerande stabilitet, minska komplexiteten och storleken av en antikropp är ofta16. Formatet S-Fab består av en Fab och en VHH, som uttrycks mycket väl i bakteriell system sannolikt på grund av enkla struktur och liten storlek.
GPC3 valdes i detta GPC3-S-Fab bispecific antikropp format. Glypikan-3 (GPC3) är en medlem av familjen heparin sulfat (HS) proteoglykan som är förankrade till cellytan genom glycosylphosphatidylinositol (GPI)18. GPC3 är överuttryckt i 70% av Hepatocellulär cancer (HCC) fall, som står för majoriteten av lever cancer19,20,21,22. Eftersom GPC3 är sällan uttrycks i normala vävnader, har GPC3 föreslagits som ett potentiellt mål för HCC. Flera mus mAbs har producerats mot GPC3. Dock endast GC33 uppvisade begränsade antitumöraktivitet 22, och det lyckades uppvisar klinisk effekt hos patienter. I denna studie visades GPC3-S-Fab för att kunna rekrytera NK-celler för att döda GPC3 tumör celler14.
För att rekrytera NK-celler, användes anti-CD16 VHH. CD16a är en låg affinitet IgG receptor, uttryckte främst på vissa subtyper av T-celler, naturliga mördarceller (NK), makrofager och monocyter. Det är involverade i antikroppsberoende cell cytotoxicitet (ADCC) av NK celler23. Mänskliga NK celler kan delas in i två typer, CD56 – CD16 + och CD56 + CD16-. I motsats till CD56 + CD16− NK-celler, CD56-CD16 + NK-celler kan släppa högre nivåer av perforin och granzym B och därmed presentera en stark cytotoxicitet24. Kupffers celler (KCs), uttrycker CD16a, är bosatta makrofager i levern. Kupffers celler har en viktig roll i undertryckandet av levercancer25. BsAbs inriktning CD16a kan således vara en mer lovande strategi än att engagera T-celler mot levercancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie presenterar vi en strategi för att konstruera ett nytt format av bsAbs, GPC3-S-Fab, som kan rekrytera NK-celler inriktning GPC3 positiv tumörceller. S-Fab är baserad på naturliga Fab format genom att lägga till en anti-CD16 VHH11,12. Jämfört med regionen bsAbs innehållande Fc, kan GPC3-S-Fab enkelt produceras i periplasm av bakterier i stor skala.
Användning av uttryck och rening strategi som beskrivs i protokol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av R & D planera i provinsen Guangdong (Kina) (2016A050503028).
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Pesquisa do Câncer. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161–an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
