GPC3 hedefleme Bispecific antikor, GPC3-S-Fab, güçlü sitotoksisite
Summary
Burada, içinde bispecific antikor GPC3-S-Fab üretmek için bir protokol mevcut Escherichia coli. Saf GPC3-S-Fab güçlü sitotoksisite karşı GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücreleri vardır.
Abstract
Bu iletişim kuralı İnşaat ve bispecific antikor (bsAb), GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları açıklanmaktadır. bsAbs iki farklı kolları aracılığıyla iki farklı epitopları tanıyabilir. bsAbs aktif olarak yeteneklerini doğrudan bağışıklık hücreleri tümör hücrelerini öldürmek için recruit için inceledik. Şu anda, bsAbs çoğunluğu rekombinant proteinler, Fc içeren bsAbs olarak veya daha küçük bsAb türevleri Fc bölge olmadan şeklinde üretilmektedir. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab, bir antikor parçası (Fab) tabanlı bispecific antikor anti-GPC3 antikor GC33 bir anti-CD16 tek etki alanı antikor ile Fab bağlama tarafından tasarlanmıştır. GPC3-S-Fab Escherichia coli ifade edilen ve iki benzeşme chromatographies tarafından arıtılmış. Saf GPC3-S-Fab özellikle bağlamak ve GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücrelerini öldürmek doğal katil hücreler, işe alma tarafından GPC3-S-Fab potansiyel bir uygulama karaciğer kanseri tedavisi öneriyor.
Introduction
Monoklonal antikor şimdi geniş kanser tedavi1için kullanılır. Antikorlar esneklik nedeniyle çeşitli antikor tabanlı biçimler aktif olarak keşfedilmeyi. Monoklonal antikorlar ile karşılaştırıldığında, bsAbs iki farklı hedefler aynı anda ve verimli bir şekilde hedef ve tümör hücreleri2öldürmek için bağışıklık efektör hücreleri alımı tetiklemek tanımasını sağlayarak iki farklı antijen bağlayıcı modülleri var.
Geçerli rekombinant bsAb biçimleri genellikle iki sınıf için atanmış: Fc içeren bsAbs ve bsAbs bir Fc bölge olmadan. Çoğunlukla memeli hücrelerinde üretilir Fc içeren biçimleri ile karşılaştırıldığında, bsAbs olmadan bir Fc bölge daha küçük boyutları, avantajları daha kolay mikroorganizma ifade sistemlerinde üretilen ve tümör doku daha verimli bir şekilde nüfuz 3.
bsAbs bir Fc bölge olmadan genellikle tek-zinciri değişken parçaları (scFvs) veya Fabs3gibi bireysel bağlama moieties bağlayarak meydana gelir. Olmadan teskin etki, scFv parçaları genellikle dayalı bsAbs termal kararlılık, düşük çözünürlük veya toplama4,5için artan bir potansiyel tehlikeye. Buna ek olarak, Fab-esaslı bsAbs CH1 ve CL heterodimerization yerli Fab yan4,6‘ nedeniyle daha istikrarlı.
Değişken etki alanından ağır zinciri yalnızca antikorlar (VHHs, tek etki alanı antikor da bilinir) doğal ağır zincir antikorlar7aktif antijen bağlayıcı parçası vardır. VHHs yüksek afinite özellikleri, geleneksel IgGs8, düşük immünojenisite ve yüksek verim özgüllük bakteriyel ifade9‘ var. FV parçaları ile karşılaştırıldığında, VHHs daha yüksek termal kararlılık10var. Fab moieties ile karşılaştırıldığında, VHHs daha küçük boyutları nedeniyle CH1 ve CL eksikliği var. Böylece, S-Fab, Fab bir tek etki alanı antikor, VHH, ile bağlantı kurarak elde bsAb biçiminde tasarlanmış ve onun anti-tümör etkisi11,12için okudu.
Bu çalışmada, GPC3-S-Fab inşaatı hGC3313 ile bir anti-CD16a VHH14 Fab bağlama tarafından tanımlanmıştır. GPC3-S-Fab, verimli bir şekilde periplasmic ifade Escherichia coli (e.coli)içinde üretilmektedir. GPC3-S-Fab fonksiyonel çalışmaları GPC3-S-Fab karaciğer kanseri tedavisi için umut verici bir strateji olduğunu düşündürmektedir. Böylece, GPC3-S-Fab avantajları alternatif teknikleri ile ilgili başvuruları önceki çalışmalarda kolay üretim ve arıtma ve daha istikrarlı bsAbs içerir.
Memeli ifade ve prokaryotik ifade sistemler BsAbs çeşitli biçimlerde ifade etmek için kullanılmaktadır. Memeli ifade sistemleri, E. coliaksine-tabanlı protein ifade sistemlerine sahip pek çok faydaları, yüksek verim, düşük maliyetli ve emek tasarrufu, genetik manipülasyon ve yüksek dönüşüm verimliliği15kolaylığı dahil olmak üzere. E. colibsAbs ifade için iki temel strateji vardır: sitoplazma ve sitoplazma ve dış hücre zarlarında15arasında periplasm ifadede ifade. Sitoplazma azaltarak çevreye, periplasm bir daha oksitleyici doğru katlanır teşvik çevre ve proteinler16ortak ifade karşılaştırılır. Doğru katlanır çözünürlük, istikrar ve işlev bsAbs üretiminde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bir sinyal sıra pelB periplasm için salgılanmasını E. coli17yönlendirmek için S Fab N-terminus eklendi. Emin olmak için doğru katlanır, çözünürlük, termal kararlılık ve konformasyon istikrar, karmaşıklığı ve bir antikor boyutunu azaltarak sık16istihdam. S-Fab biçimi bir Fab ve bakteriyel sistemlerinde basit yapısı ve küçük boyutu nedeniyle büyük olasılıkla çok iyi ifade edilen bir VHH oluşur.
GPC3 bu GPC3-S-Fab bispecific antikor biçimde seçildi. Glypican-3 (GPC3) ile glycosylphosphatidylinositol (GPI)18hücre yüzeyine demirli heparin sülfat (HS) proteoglikan ailesinin bir üyesidir. GPC3 karaciğer kanserleri19,20,21,22çoğunluğu için hangi hesabı % 70 hepatosellüler karsinom (HCC) olguların overexpressed. GPC3 nadiren normal dokulara ifade edilir çünkü GPC3 HCC için potansiyel bir hedef teklif edildi. Birden çok fare mAbs GPC3 karşı üretilen. Ancak, sadece GC33 sınırlı anti-tümör faaliyet 22sergiledi ve bu hastalarda klinik etkinlik sergilemek için başarısız oldu. Bu çalışmada, GPC3-S-Fab NK hücreleri GPC3 tümör hücreleri14öldürmek için recruit edebilmek için gösterildi.
NK hücreleri toplamak için anti-CD16 VHH kullanıldı. CD16a esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar, monosit ve bazı alt türlerinden T hücrelerinin üzerinde ifade bir düşük benzeşme IgG reseptör var. NK hücreleri23tarafından antikor bağımlı hücre sitotoksisite (CCDA) ilgilenmektedir. İnsan NK hücreleri iki türe, CD56 kategorize – CD16 + ve CD56 + CD16-. CD56 + CD16− NK hücreleri, CD56 aksine-CD16 + NK hücreleri serbest bırakmak daha yüksek düzeyde perforin ve granzyme B ve böylece güçlü sitotoksisite24mevcut. CD16a, ifade Kupffer hücreleri (KCs), karaciğerde ikamet makrofajlar vardır. Kupffer hücreleri karaciğer kanseri25bastırılması içinde önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, CD16a hedefleme bsAbs T hücrelerinin karaciğer kanserine karşı ilgi çekici daha bir daha umut verici strateji olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, biz bsAbs, yeni bir biçim oluşturmak için bir strateji mevcut GPC3-S-hangi GPC3 pozitif tümör hücreleri hedefleme NK hücreleri askere Fab. S-Fab üzerinde doğal Fab dayalı bir anti-CD16 VHH11,12ekleyerek biçimi. BsAbs içeren Fc bölge ile karşılaştırıldığında, GPC3-S-Fab kolayca bakteri büyük ölçüde periplasm olarak üretilmektedir.
İletişim kuralında tanımlanan ifade ve arıtma stratejisi k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser mali R & D planı, Guangdong Eyaleti (PR Çin) (2016A050503028) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, S21-S28 (2015).
- Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
- Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
- Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
- Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
- Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
- Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
- Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977 (2017).
- Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653 (2017).
- Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
- Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32 (2016).
- Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
- Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
- Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
- Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
- Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
- Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
- Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
- Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
- Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
- Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Pesquisa do Câncer. 57 (22), 5179-5184 (1997).
- Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161–an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
- Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
- Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).
