Un targeting GPC3 bispecifico, GPC3-S-Fab, con potente citotossicità
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre un bispecifico GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Purificata GPC3-S-Fab ha potente citotossicità contro le cellule di cancro del fegato positivo GPC3.
Abstract
Questo protocollo descrive la costruzione e gli studi funzionali di un bispecifico (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs in grado di riconoscere due epitopi diversi attraverso le due armi diverse. bsAbs sono stati attivamente studiati per la loro capacità di reclutare direttamente le cellule immunitarie per uccidere le cellule del tumore. Attualmente, la maggior parte dei bsAbs è prodotte in forma di proteine ricombinanti, come Fc-contenenti bsAbs o come più piccolo bsAb derivati senza regione Fc. In questo studio, è stato progettato GPC3-S-Fab, un anticorpo frammento (Fab) base bispecifico, collegando il Fab dell’anticorpo anti-GPC3 GC33 con un anticorpo anti-CD16 di singolo dominio. Il GPC3-S-Fab può essere espressa in Escherichia coli e purificato da due cromatografie di affinità. Purificata GPC3-S-Fab in particolare può associare a e uccidere le cellule di cancro del fegato positivo GPC3 reclutando cellule natural killer, suggerendo una potenziale applicazione di GPC3-S-Fab nella terapia del cancro del fegato.
Introduction
Gli anticorpi monoclonali sono ora ampiamente utilizzati per cancro trattamento1. Grazie alla flessibilità degli anticorpi, vari formati basati su anticorpi sono stati esplorati attivamente. Rispetto agli anticorpi monoclonali, bsAbs hanno due moduli di associazione differenti dell’antigene, consentendo loro di riconoscere due bersagli contemporaneamente e in modo efficiente innescano il reclutamento di cellule immunitarie effettrici per colpire e uccidere le cellule di tumore2.
Formati attuali bsAb ricombinante possono essere generalmente assegnati a due classi: Fc-contenente bsAbs e bsAbs senza una regione Fc. Rispetto ai formati contenenti Fc che sono prodotti principalmente in cellule di mammifero, bsAbs senza una regione Fc hanno i vantaggi di più piccole dimensioni, sono più facilmente prodotti in sistemi di espressione del microorganismo e può penetrare tessuti del tumore in modo più efficiente 3.
bsAbs senza una regione Fc sono formate comunemente collegando moiety singola associazione, ad esempio frammenti di catena singola variabile (scFvs) o Fabs3. Senza i domini stabilizzanti, bsAbs basato su frammenti di scFv spesso hanno compromesso la stabilità termica, bassa solubilità o un potenziale aumento di aggregazione4,5. Al contrario, basati su Fab bsAbs sono più stabili a causa l’eterodimerizzazione del CH1 e CL in nativo frazione Fab4,6.
Dominio variabile da anticorpi solo pesante-catena (VOX, noto anche come anticorpi di singolo dominio) sono il frammento attivo antigene-legante di catena pesante naturale anticorpi7. VOX ha le caratteristiche di alta affinità, specificità del convenzionale IgGs8, bassa immunogenicità e alti rendimenti in espressione batterica9. Rispetto ai frammenti di Fv, Vox hanno maggiore stabilità termica10. Rispetto ai Fab moiety, Vox hanno dimensioni inferiori a causa della mancanza di CH1 e CL. Così, S-Fab, il formato di bsAb ottenuto collegando il favoloso con un anticorpo di singolo dominio, inquinamenti, è stato progettato e studiato per suoi effetti anti-tumorali11,12.
In questo studio, la costruzione di GPC3-S-Fab collegando il Fab di hGC3313 con un anti-CD16a VHH14 è stata descritta. Il GPC3-S-Fab può essere prodotto in modo efficiente dall’espressione periplasmica in Escherichia coli (Escherichia coli). Gli studi funzionali di GPC3-S-Fab ha suggerito che GPC3-S-Fab è una strategia promettente per la terapia del cancro del fegato. Così, i vantaggi di GPC3-S-Fab su tecniche alternative con riferimenti applicabili agli studi precedenti includono facile produzione e purificazione e bsAbs più stabile.
Sistemi di espressione dei mammiferi e sistemi di espressione procariotici sono stati utilizzati per esprimere vari formati di BsAbs. Contrariamente ai sistemi di espressione dei mammiferi, e. coli-sistemi di espressione della proteina di base hanno molti vantaggi, tra cui alti rendimenti, basso costi e risparmio di lavoro, la facilità di manipolazioni genetiche e di trasformazione ad alta efficienza15. Per bsAbs espressione in e. coli, ci sono due strategie di base: espressione nel citoplasma ed espressione nel Periplasma tra il citoplasma e membrane cellulari esterno15. Rispetto per l’ambiente riducente di citoplasma, il Periplasma è un ambiente, che promuove il corretto ripiegamento più ossidanti e la co-espressione di proteine16. Piegatura corretta svolge un ruolo chiave nella generazione di solubilità, stabilità e funzione di bsAbs. Di conseguenza, un pelB di sequenza segnale è stato aggiunto al N-terminale della S-Fab per dirigere la secrezione per il Periplasma di e. coli17. Per garantire la corretta pieghevole, solubilità, stabilità termica e stabilità conformazionale, riducendo la complessità e la dimensione di un anticorpo è frequentemente impiegato16. Il formato S-Fab è costituito da un Fab e uno VHH, che si esprime molto bene in sistemi batterici probabilmente dovuto la struttura semplice e di piccole dimensioni.
GPC3 è stato scelto in questo formato di anticorpo anticorpo GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) è un membro della famiglia di proteoglycan solfato (HS) di eparina che è ancorata alla superficie delle cellule attraverso glicosilfosfatidilinositolo (GPI)18. GPC3 è iperespresso nel 70% dei casi di carcinoma (HCC) epatocellulare, che rappresentano la maggior parte dei tumori del fegato19,20,21,22. Poiché GPC3 è raramente espresse in tessuti normali, GPC3 è stato proposto come un potenziale bersaglio per HCC. Più anticorpi monoclonali di topo sono state prodotte contro GPC3. Tuttavia, solo GC33 ha esibito un’attività anti-tumorale limitata 22, e non è riuscito a mostrare l’efficacia clinica in pazienti. In questo studio, GPC3-S-Fab è stato indicato per essere in grado di reclutare le cellule NK per uccidere GPC3 tumore cellule14.
Per reclutare le cellule NK, anti-CD16 VHH è stato utilizzato. CD16a è un recettore a bassa affinità IgG, espresso principalmente sulle cellule natural killer (NK), macrofagi, monociti e alcuni sottotipi di cellule T. È coinvolto nella citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) di cellule NK23. Cellule NK umane possono essere suddivise in due tipi, CD56 – CD16 + e CD56 + CD16-. Contrariamente alle cellule NK CD56 + CD16−, CD56-cellule CD16 + NK possono rilasciare livelli più elevati di perforina e granzyme B e presentano quindi una forte citotossicità24. Cellule di Kupffer (KCs), esprimendo CD16a, sono i macrofagi residenti nel fegato. Cellule di Kupffer giocano un ruolo importante nella soppressione di cancro del fegato25. Quindi, bsAbs CD16a di targeting può essere una strategia più promettente rispetto coinvolgente cellule T contro il cancro del fegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, presentiamo una strategia per costruire un nuovo formato di bsAbs, GPC3-S-Fab, che possono reclutare cellule NK mirare alle cellule del tumore positivo GPC3. La S-Fab è basato sul Fab naturale formato con l’aggiunta di un anti-CD16 VHH11,12. Confrontato con la regione di Fc contenente bsAbs, GPC3-S-Fab possono essere prodotte facilmente nel Periplasma dei batteri su larga scala.
Utilizzando la strategia di espression…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal R & D piano della provincia di Guangdong (Cina) (2016A050503028).
Materials
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
Referências
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