Este manuscrito descreve um protocolo para estudar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica 5-aminolevulínico mediada por ácido (ALA-PDT) sobre um biofilme de Staphylococcus aureus . Este protocolo pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes bacterianos com PDT no futuro.
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Artigo de método
Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Staphylococcus aureus (S. aureus) é um patógeno humano comum, que causa infecções sistêmicas e piogênica. S. aureus infecções são difíceis de erradicar, não só devido ao surgimento de cepas resistentes aos antibióticos, mas também sua capacidade de forma de biofilmes. Recentemente, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido indicada como um dos tratamentos possíveis para controlar infecções de biofilme. No entanto, mais estudos são necessários para melhorar o nosso conhecimento de seus efeitos sobre biofilmes bacterianos, bem como os mecanismos subjacentes. Este manuscrito descreve um modelo in vitro do PDT com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), um precursor do fotossensibilizador real, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduras S. aureus biofilmes foram incubados com ALA e em seguida, expostos à luz. Posteriormente, o efeito antibacteriano do ALA-PDT no biofilme de S. aureus foi quantificado calculando as unidades (CFUs) formadoras e visualizado pela viabilidade fluorescente coloração através de laser confocal, microscopia (CLSM). Resultados representativos demonstraram um forte efeito antibacteriano do ALA-PDT sobre biofilmes de S. aureus . Este protocolo é simples e pode ser usado para desenvolver um modelo in vitro para estudar o tratamento de biofilmes de S. aureus com ALA-PDT. No futuro, ela também pode ser referenciada em estudos de PDT, utilizando outros fotossensibilizadores para diferentes cepas bacterianas com ajustes mínimos.
Introdução
S. aureus é um importante patógeno Gram-positiva que coloniza a pele e mucosa de hospedeiros humanos. Sua capacidade de forma de biofilmes é considerada um aspecto importante de sua patogênese1. Biofilmes bacterianos são uma comunidade de bactérias incorporado em uma matriz de produção própria, que é composta de substâncias poliméricas extracelulares, incluindo polissacarídeo, DNA e proteínas. Esta matriz desempenha um papel significativo na persistência de infecções bacterianas, contribuindo para um alto grau de resistência ao sistema imunológico humano e terapias antimicrobiana atual2. Os antibióticos são aind....
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Protocolo
1. formação de biofilmes
-
Formação de biofilmes em microplacas de 96 poços
- Recuperar a cepa S. aureus USA300 e 3 formadoras de biofilme clínicas cepas (C1 - C3) armazenadas a-80 ° C.
Nota: A capacidade das estirpes clínicas para formar biofilmes foi determinada pelo ensaio de placa de microtitulação descrito anteriormente15. - Inocular a bactéria num meio de caldo (TSB) 5ml triptona soja e cultivar em uma incubadora com agitação a 37 ° C durante a noite para a fase estacionária.
- Centrifugar a cultura bacteriana durante a noite a 4.000 x g durante 10 minutos a 25 ° C e em segui....
- Recuperar a cepa S. aureus USA300 e 3 formadoras de biofilme clínicas cepas (C1 - C3) armazenadas a-80 ° C.
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Resultados
A viabilidade das bactérias nos biofilmes foi diminuída após o tratamento de ALA-PDT quando comparados aos controles (ALA - diodo emissor de luz, ALA + LED - e ALA-LED +) em USA300 e das três estirpes clínicas (Figura 1).
Para confirmar os resultados do UFC ensaio e observam o antibacteriano, efeito de ALA-PDT sobre o S. aureus biofilme em situ, os biofilmes USA300 foram visualizad.......
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Discussão
PDT tem sido uma terapia estudada para o tratamento de câncer, desde que foi inventado há mais de 100 anos18. Na última década, PDT foi aplicado como uma estratégia antimicrobiana e demonstrou eficácia contra algumas bactérias patogénicas resistentes a antibióticos,12. Comparado ao estado planctônico, biofilmes bacterianos parecem ser mais resistentes ao tratamento com antibióticos3, enquanto o efeito de ALA-PDT em biofilmes não foi totalmente invest.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela natureza nacional Science Foundation da China para jovens estudiosos (n º 81300810), programa de treinamento de Shanghai jovem médico (n º 20141057) e Nacional Natural Science Foundation da China (81671982, 81271791 e 81571955). Gostaríamos de agradecer LetPub (www.letpub.com) para fornecer assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Caldo de Soja Triptona (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Ágar Soja Triptona (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Os Kits de Viabilidade Bacteriana BacLight VIVOS/MORTOS |
| Iodeto de propídio (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Os Kits de Viabilidade Bacteriana BacLight VIVO/MORTO |
| Pancreatina | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| Ácido 5-aminolevulínico (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus cepa USA300 | / | / | A fonte dos EUA 300 referências " Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. Setembro de 2009; 64(3):441-6". |
| Staphylococcus aureus cepas clínicas (C1-C3) | / | / | Todas as cepas clínicas foram isoladas de pacientes com rinossinusite crônica no Departamento de Otorrinolaringologia-Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital de Olhos e Otorrinolaringologia da Universidade de Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| Microplaca de 96 poços | Corning Inc | 3599 | Microplacas de Poliestireno de Fundo Plano Transparente Tratadas com TC, Embaladas Individualmente, com Tampa, |
| Fluorado Estéril | NEST Biotechnology | 801001 | Fundo de Vidro, Tubos Eppendorf Safe-Lock Não Pirogênicos |
| , 1.5 mL Eppendorf | 0030120086 | ||
| Microcentrífuga Eppendorf 5417 | Eppendorf | Z365998 | Incubadora SIGMA | |
| Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Agitadores orbitais de bancada | |
| Diodo emissor de luz (LED) | Wuhan Yage Técnica óptica e eletrônica CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 microscópio confocal de varredura a laser | Leica Microsystems | ||
| LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
Referências
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A.
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Reimpressões e permissões
