Plante-mikrobe interaktion: Transcriptional svar af Bacillus Mycoides kartoffel Root ekssudater
Summary
Målet med protokollen præsenteres her er at studere transkriptom svar på endosphere-isolerede Bacillus mycoides kartoffel root ekssudater. Denne metode fremmer identifikation af vigtige bakteriel gener involveret i plante-mikrobe interaktioner og er i princippet gælder for andre endofytter og planter, med mindre justeringer.
Abstract
Gavnlige plante-forbundet bakterier spille en vigtig rolle i at fremme vækst og forebyggelse af sygdomme i planter. Anvendelse af plante vækstfremmende rhizobacteria (PGPR) som biofertilizers eller biocontrol agenter er blevet et effektivt alternativ til brugen af konventionel gødning og kan øge høstudbyttet til en lav pris. Plante-mikrobe interaktioner afhænge vært plante-udskilles signaler og en reaktion hereon af deres tilknyttede bakterier. Men de molekylære mekanismer af hvordan gavnlige bakterier reagerer på deres tilknyttede plantebaserede signaler ikke er fuldt forstået. Vurdering af transkriptom svar af bakterier til roden ekssudater er en kraftfuld tilgang til at bestemme den bakterielle genekspression og forordning rhizospheric vilkår. Denne viden er nødvendig for at forstå de underliggende mekanismer involveret i plante-mikrobe interaktioner. Dette papir beskriver en detaljeret protokol for at studere transkriptom svar af B. mycoides EF18, en stamme isoleret fra endosphere kartoffel til kartoffel root ekssudater. Med hjælp fra de seneste høj overførselshastighed sekventering teknologi, kan denne protokol udføres i flere uger og producere massive datasæt. Først, vi samle root ekssudater under sterile forhold, hvorefter de er føjet til B. mycoides kulturer. RNA fra disse kulturer er isoleret ved hjælp af en fenol/chloroform metode kombineret med en kommerciel kit og underkastes kvalitetskontrol af et automatiseret elektroforese instrument. Efter sekvensering, dataanalyse er udført med web-baseret T-REx pipeline og en gruppe af varierende udtrykte gener er identificeret. Denne metode er et nyttigt værktøj til at lette nye opdagelser på de bakterielle gener involveret i plante-mikrobe interaktioner.
Introduction
Planter kan ekssudat op til 20% af kulstoffet fast under fotosyntesen gennem rødderne ind i rhizosfære1, dvs., den smalle zone af jorden i nærheden af rødderne. På grund af den højere næringsstoftilgængelighed er rhizosfære et velegnet levested for forskellige mikroorganismer, herunder plantevækst fremme bakterier. Roden ekssudater indeholder en række uorganiske forbindelser som ioner, uorganiske syrer, ilt og vand. Men størstedelen af roden ekssudater er dannet af organiske materialer, som kan opdeles i lavmolekylære forbindelser og høj molekylvægt forbindelser. De lavmolekylære forbindelser omfatter aminosyrer, organiske syrer, sukker, phenolforbindelser, fedtsyrer og en bred vifte af sekundære metabolitter. Høj molekylvægt forbindelser består af planteslim og proteiner2,3. Rhizosfære mikroorganismer kan bruge nogle af disse forbindelser som energikilde for vækst og udvikling. Roden ekssudater spiller en vigtig rolle i udformningen af Fællesskabets rhizobacterial da de anlæg-produceret forbindelser i ekssudater kan påvirke funktionsmåden for rhizosfære-associerede bakterier ved at påvirke udtryk af specifikke gener.
Forstå den bakterielle reaktion på rod ekssudater er et vigtigt skridt i afkodning plante-mikrobe interaktion mekanismer. Som den bakterielle svar på plante-mikrobe interaktioner er produktet af differential genekspression, kan det blive undersøgt af transkriptom analyse. Brug denne metode, identificeret tidligere undersøgelser flere vigtige gener involveret i plante-mikrobe interaktioner. I Pseudomonas aeruginosa, blev gener involveret i stofskiftet, chemotaxis og type II sekretion vist til at reagere på sukkerroer root ekssudater4. Fan mfl. 5 studerede transkriptom profilering af B. amyloliquefaciens FZB42 svar på majs root ekssudater. Deres resultater viser, at flere grupper af de gener, stærkt foranlediget af roden ekssudater, er involveret i stofskifteveje vedrørende næringsstofudnyttelse, chemotaxis, motilitet og ikke-ribosomale syntese af antimikrobielle peptider og polyketider.
Nøjagtigheden af disse undersøgelser bygger på indsamling af roden ekssudater. Selv om flere metoder har beskrevet samling af roden ekssudater til forskellige formål, de enten kræver avancerede instrumenter eller udføres ikke i velkontrollerede betingelser6,7,8. Desuden rhizosfære-hæmmende mikroorganismer kan påvirke root ekssudat sammensætning ved at påvirke plante celle membran permeabilitet og beskadige root væv, især i tilfælde af konsortier af mikroorganismer9. Når undersøger den mikrobielle reaktion på rod ekssudater, er det vigtigt at bruge veldefinerede betingelser for at undgå ændring af forbindelser med andre mikroorganismer10. Derudover kræves høj kvalitet RNA til RNA-seq baseret transkriptom undersøgelser. Men når der beskæftiger sig med ikke-model-bakterielle stammer, standardprotokoller eller kommercielle kits normalt har en lav effektivitet på grund af ukendte faktorer eller særlige vækstegenskaber.
Protokollen beskrevet her blev kontrolleret ved hjælp af B. mycoides, som er en gram-positive, spore-dannende bakterie af Firmicute phylum. Det er allestedsnærværende i rhizosfære af forskellige plantearter. Flere anlæg vækst fremme egenskaber er blevet rapporteret for denne art, herunder induktion af systematiske modstand (ISR) i sukkerroer11, hæmning af dæmpning-off patogenet Pythium for agurk12, samt kvælstof fiksering i solsikke rhizosfære13. Men, dens interaktion med en vært plante molekylære mekanismer er ikke godt undersøgt.
Formålet med forsøgene præsenteres her er at studere transkriptom svar på endosphere-isolerede B. mycoides kartoffel root ekssudater. Kort sagt, protokollen består af følgende trin: først, indsamle kartoffel root ekssudater under sterile forhold. Udtræk høj kvalitet RNA fra bakterieceller behandlet med root ekssudater. Det sidste trin er dataanalyse ved hjælp af web-baseret T-REx pipeline14. Denne protokol blev brugt til at identificere B. mycoides gener, der viser et skift i udtryk niveauer ved kontakt med root-ekssudater og dermed kan spille en vigtig rolle i plante-mikrobe interaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plante-mikrobe interaktioner er blevet hypotese at være bestemt af en fint afstemt balance mellem bakterier og planter. Sådanne interaktioner er meget komplekse og vanskelige at studere i et naturligt system, som omfatter forskellige mikrobielle arter, potentielt handler som konsortier. Dette papir beskriver en forenklet protokol for at studere den bakterielle reaktion på rod ekssudater under velkontrollerede omstændigheder. Transkriptom profil af rhizobacteria ved udsættelse for root ekssudater, giver detaljerede o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jakob Viel for hans nyttige kommentarer og forslag. Vi takker også Anne de Jong for hans hjælp i bioinformatik analyse. Yanglei Yi og Zhibo Li understøttes af Kina stipendium Rådet (CSC). Vi takker NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) for deres finansielle støtte til OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
Referências
- Haichar, F. e. Z., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -. H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
