الميكروبات والنباتات التفاعل: استجابة النسخي Bacillus ميكويديس للإفرازات الجذرية البطاطا
Summary
وهدف البروتوكول المعروضة هنا دراسة استجابة ترانسكريبتوميك اندوسفيري-المعزولة Bacillus ميكويديس للإفرازات الجذرية البطاطا. هذا الأسلوب يسهل تحديد الجينات البكتيرية الهامة المشاركة في التفاعلات بين الميكروبات والنبات وهو مبدأ ينطبق على اندوفيتيس والنباتات، مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة الأخرى.
Abstract
البكتيريا المفيدة المرتبطة بالنباتات تلعب دوراً هاما في تعزيز النمو والوقاية من الأمراض في النباتات. تطبيق رهيزوباكتيريا تشجيع نمو النبات (PGPR) كوكلاء الأسمدة أو عشب أصبح بديل فعال لاستخدام الأسمدة التقليدية ويمكن زيادة إنتاجية المحاصيل بتكاليف منخفضة. التفاعلات بين الميكروبات والنبات تعتمد على إشارات يفرز النبات المضيف، ورد الممتلكات من البكتيريا المقترنة بها. بيد أن الآليات الجزيئية للبكتيريا المفيدة كيف تستجيب ليرتبط المشتقة من النباتات إشارات غير مفهومة تماما. تقييم استجابة ترانسكريبتوميك البكتيريا للإفرازات الجذرية نهج قوية لتحديد الجينات البكتيرية وتنظيم ظروف رهيزوسفيريك. هذه المعرفة أمر ضروري لفهم الآليات الكامنة التي تشارك في التفاعلات بين الميكروبات والنبات. وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصل لدراسة رد ترانسكريبتوميك ميكويديس EC18، سلالة معزولة من اندوسفيري البطاطا، للإفرازات الجذرية البطاطا. مع مساعدة التكنولوجيا التسلسل الفائق الأخيرة، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في عدة أسابيع وإنتاج مجموعات ضخمة. أولاً، نقوم بجمع الإفرازات الجذرية تحت ظروف معقمة، بعد التي يتم إضافتها إلى الثقافات mycoides باء . الجيش الملكي النيبالي من هذه الثقافات معزولة باستخدام أسلوب فينول/كلوروفورم جنبا إلى جنب مع مجموعة تجارية وتخضع لمراقبة الجودة بصك التفريد الآلي. بعد التسلسل، هو إجراء تحليل البيانات مع أنبوب تي ركس المستندة إلى ويب وهو تحديد مجموعة من الجينات الأثران المعرب عنها. هذا الأسلوب أداة مفيدة لتسهيل الاكتشافات الجديدة في الجينات البكتيرية المشتركة في التفاعلات بين الميكروبات والنبات.
Introduction
النباتات قد نضحة تصل إلى 20 في المائة الكربون ثابتة خلال عملية التمثيل الضوئي من خلال الجذور rhizosphere1، أي، منطقة ضيقة من التربة قرب الجذور. نظراً لتوافر المغذيات أعلى، rhizosphere كموئل مناسب للكائنات الدقيقة المتنوعة، بما في ذلك البكتيريا تشجيع نمو النباتات. نتحات الجذر يحتوي على مجموعة من المركبات غير العضوية مثل الأيونات والأحماض غير العضوية والأكسجين والماء. ومع ذلك، معظم الإفرازات الجذرية شكلتها المواد العضوية، والتي يمكن تقسيمها إلى مركبات الوزن الجزيئي المنخفض وارتفاع الوزن الجزيئي المركبات. وتشمل المركبات منخفضة الوزن الجزيئي الأحماض الأمينية والأحماض العضوية والسكريات، والمركبات الفينولية، والأحماض الدهنية ومجموعة واسعة من نواتج الأيض الثانوية. تتكون مركبات عالية الوزن الجزيئي من الصمغ والبروتينات2،3. يمكن استخدام الكائنات المجهرية رهيزوسفيري بعض من هذه المركبات كمصدر للطاقة للنمو والتنمية. الإفرازات الجذرية تلعب دوراً هاما في تشكيل المجتمع رهيزوباكتيريال نظراً للمركبات المنتجة في مصنع في الإفرازات يمكن التأثير على سلوك البكتيريا rhizosphere المرتبطة بالتأثير على الجينات المحددة.
فهم رد بكتيرية على الإفرازات الجذرية خطوة رئيسية في فك رموز آليات التفاعل الميكروبات والنباتات. كما رد البكتيرية للتفاعلات بين الميكروبات والنبات هو نتاج التعبير الجيني التفاضلي، فإنه يمكن دراستها بتحليل الترنسكربيتوم. باستخدام هذا الأسلوب، دراسات سابقة حددت عدة جينات هامة تشارك في التفاعلات بين الميكروبات والنبات. في الزائفة الزّنجاريّة، عرضت الجينات المشتركة في الأيض وانزيمية، والنوع الثاني إفراز الاستجابة بنجر السكر الجذرية نتحات4. مروحة وآخرون. 5 دراسة التنميط ترانسكريبتوميك من FZB42 أميلوليقويفاسينس (ب) استجابة للإفرازات جذر الذرة. وتظهر نتائجها، عدة مجموعات من الجينات بشدة فعل الإفرازات الجذرية، تشارك في الأيضية المتصلة باستخدام المغذيات وانزيمية وحركية والتوليف غير ريبوسومال الببتيدات المضادة للميكروبات و polyketides.
تعتمد دقة هذه الدراسات على جمع الإفرازات الجذرية. على الرغم من أن وصف عدة طرق جمع الإفرازات الجذرية لأغراض مختلفة، أنها تتطلب أدوات متطورة أو لا تتم في ظروف خاضعة للرقابة جيدا6،،من78. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر الكائنات المجهرية التي تحول دون رهيزوسفيري تكوين الإفرازات الجذرية التي تؤثر على نفاذية غشاء الخلية النباتية وإلحاق الضرر بأنسجة الجذر، لا سيما في حالة اتحادات للكائنات الحية الدقيقة9. عند التحقيق في الاستجابة للميكروبات للإفرازات الجذرية، من المهم استخدام شروط محددة تحديداً جيدا تفاديا لتغيير المركبات بسائر الكائنات الحية الدقيقة10. وعلاوة على ذلك، مطلوب رنا عالية الجودة لتسلسل الحمض النووي الريبي على أساس دراسات الترنسكربيتوم. ومع ذلك، عند التعامل مع السلالات البكتيرية النموذجية غير، البروتوكولات القياسية أو مجموعات تجارية وعادة ما يكون كفاءة منخفضة بسبب عوامل غير معروفة أو خصائص النمو الخاصة.
تم التحقق من البروتوكول بوصفها هنا باستخدام ميكويديس (ب)، وبكتيريا إيجابية، وتشكيل بوغ من الأسرة في اللغات فيرميكوتي. وموجود في كل مكان في رهيزوسفيري من مختلف الأنواع النباتية. قد تم الإبلاغ عن عدة خصائص تشجيع نمو النبات لهذه الأنواع، بما في ذلك تحريض منهجي المقاومة (ISR) في بنجر السكر11، تثبيط التخميد قبالة الممرض بيثيوم لخيار12، فضلا عن النتروجين التثبيت في عباد الشمس رهيزوسفيري13. ومع ذلك، الآليات الجزيئية لتفاعلها مع مصنع لمضيف لم تدرس جيدا.
والهدف من هذه التجارب المقدمة هنا دراسة استجابة ترانسكريبتوميك اندوسفيري-المعزولة ميكويديس باء- للإفرازات الجذرية البطاطا. وباختصار، البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: أولاً، جمع الإفرازات الجذرية البطاطس تحت ظروف معقمة. بعد ذلك، استخراج الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الخلايا البكتيرية تعامل مع الإفرازات الجذرية. والخطوة الأخيرة تحليل البيانات باستخدام خط أنابيب تي ركس المستندة إلى ويب14. هذا البروتوكول المستخدم لتحديد الجينات ميكويديس (ب) أن تظهر تحولاً في مستويات التعبير عند ملامسة الإفرازات الجذرية، وهكذا قد تلعب دوراً هاما في التفاعلات بين الميكروبات والنبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
التفاعلات بين الميكروبات والنبات وقد تم الافتراض يحدده توازناً دقيقا بين البكتيريا والنباتات. مثل هذه التفاعلات المعقدة للغاية وصعبة للدراسة في نظام طبيعي، التي تضم مختلف الأنواع الميكروبية، يحتمل أن يتصرف كاتحادات. وتصف هذه الورقة بروتوكول مبسط لدراسة رد بكتيرية على الإفرازات الجذرية…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيد جاكوب Viel على تعليقات مفيدة واقتراحاته. ونشكر أيضا أن دي يونغ لمساعدته في تحليل المعلومات البيولوجية. يي يانجلي ولي زهيبو معتمدة من مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC). ونحن نشكر جمعية البحث العلمي الهولندية-شركة TTW بيرسبيكتيف Back2Roots غاب (TKI-AF-15510) لتقديم الدعم المالي إلى OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
Referências
- Haichar, F. e. Z., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -. H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
