Plant-सूक्ष्म जीव जनसंवाद: आलू की जड Exudates को बैसिलस Mycoides की Transcriptional प्रतिक्रिया
Summary
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य आलू की जड़ exudates को endosphere-पृथक बैसिलस mycoides की transcriptomic प्रतिक्रिया का अध्ययन करना है. इस विधि संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत में शामिल महत्वपूर्ण जीवाणु जीन की पहचान की सुविधा और मामूली समायोजन के साथ अन्य endophytes और पौधों के लिए लागू सिद्धांत में है ।
Abstract
लाभकारी संयंत्र-जुड़े बैक्टीरिया विकास को बढ़ावा देने और पौधों में रोग की रोकथाम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । जैव उर्वरकों या जैव नियंत्रण एजेंटों के रूप में पादप विकास-को बढ़ावा देने वाले rhizobacteria (PGPR) के आवेदन पारंपरिक उर्वरकों के उपयोग के लिए एक प्रभावी विकल्प बन गए हैं और कम लागत पर फसल की उत्पादकता बढ़ा सकते हैं. संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत मेजबान संयंत्र पर निर्भर स्रावित संकेतों और उनके जुड़े बैक्टीरिया द्वारा hereon एक प्रतिक्रिया. हालांकि, कैसे लाभकारी बैक्टीरिया का आणविक तंत्र उनके संबद्ध संयंत्र के लिए प्रतिक्रिया व्युत्पंन संकेत पूरी तरह से समझ में नहीं हैं । exudates रूट करने के लिए बैक्टीरिया की transcriptomic प्रतिक्रिया का आकलन rhizospheric शर्तों के तहत बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति और विनियमन निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. ऐसे ज्ञान को पादप-सूक्ष्म जीव बातचीत में शामिल अंतर्निहित तंत्र को समझना आवश्यक है. यह कागज एक विस्तृत mycoides EC18, आलू endosphere से अलग तनाव, आलू की जड़ exudates के transcriptomic प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । हाल ही में उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रौद्योगिकी की मदद के साथ, इस प्रोटोकॉल कई हफ्तों में किया जा सकता है और बड़े पैमाने पर डेटासेट का उत्पादन । सबसे पहले, हम बाँझ शर्तों के तहत जड़ exudates इकट्ठा, जिसके बाद वे mycoides संस्कृतियों के लिए जोड़ रहे हैं । इन संस्कृतियों से आरएनए एक वाणिज्यिक किट के साथ संयुक्त एक phenol/क्लोरोफॉर्म विधि का उपयोग कर अलग है और एक स्वचालित ट्रो साधन द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन है । अनुक्रमण के बाद, डेटा विश्लेषण वेब आधारित टी-रेक्स पाइपलाइन के साथ किया जाता है और विभेदक व्यक्त जीन के एक समूह की पहचान की है । इस विधि के जीवाणु जीन संयंत्र में शामिल-सूक्ष्म जीव बातचीत पर नई खोजों की सुविधा के लिए एक उपयोगी उपकरण है ।
Introduction
पौधों को जड़ों के माध्यम से rhizosphere1, यानी, जड़ों के पास मिट्टी के संकीर्ण क्षेत्र में प्रकाश संश्लेषण के दौरान तय की कार्बन के 20% तक रिसाव सकता है । उच्च पोषक तत्व की उपलब्धता के कारण, rhizosphere विविध सूक्ष्मजीवों के लिए एक उपयुक्त निवास स्थान है, जिसमें पौधे की वृद्धि बैक्टीरिया को बढ़ावा देना है । जड़ exudates आयनों, अकार्बनिक एसिड, ऑक्सीजन, और पानी की तरह अकार्बनिक यौगिकों की एक सीमा होते हैं । तथापि, जड़ exudates के बहुमत कार्बनिक पदार्थों, जो कम आणविक वजन यौगिकों और उच्च आणविक वजन यौगिकों में विभाजित किया जा सकता द्वारा बनाई है । कम आणविक वजन यौगिकों अमीनो एसिड, कार्बनिक एसिड, शर्करा, phenolic यौगिकों, फैटी एसिड, और माध्यमिक चयापचयों की एक सरणी शामिल हैं । उच्च आणविक वजन यौगिकों कफ और प्रोटीन से मिलकर बनता है2,3. Rhizosphere सूक्ष्मजीवों विकास और विकास के लिए एक ऊर्जा स्रोत के रूप में इन यौगिकों में से कुछ का उपयोग कर सकते हैं । जड़ exudates rhizobacterial समुदाय को आकार देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के बाद से संयंत्र के exudates में उत्पादित यौगिकों विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने से rhizosphere-जुड़े बैक्टीरिया के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं.
जड़ exudates के जीवाणु की प्रतिक्रिया को समझना संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत तंत्र को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम है । के रूप में संयंत्र के जीवाणु प्रतिक्रिया-सूक्ष्म जीव बातचीत अंतर जीन अभिव्यक्ति का उत्पाद है, यह transcriptome विश्लेषण द्वारा अध्ययन किया जा सकता है । इस विधि का प्रयोग, पिछले अध्ययनों कई महत्वपूर्ण संयंत्र में शामिल जीन की पहचान-सूक्ष्म जीव बातचीत । Pseudomonas aeruginosaमें, चयापचय, chemotaxis, और प्रकार द्वितीय स्राव में शामिल जीन को चीनी चुकंदर जड़ exudates4का जवाब दिखाया गया । फैन एट अल. 5 ने मक्का रूट exudates के जवाब में amyloliquefaciens FZB42 के transcriptomic profile का अध्ययन किया । उनके परिणाम बताते है कि, दृढ़ता से रूट exudates द्वारा प्रेरित जीन की, कई समूहों चयापचय रास्ते पोषक तत्व उपयोग, chemotaxis, गतिशीलता, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और polyketides के गैर राइबोसोमल संश्लेषण से संबंधित में शामिल हैं ।
इन अध्ययनों की सटीकता रूट exudates के संग्रह पर निर्भर करता है । हालांकि कई तरीकों अलग प्रयोजनों के लिए रूट exudates के संग्रह का वर्णन किया है, वे या तो परिष्कृत उपकरणों की मांग या अच्छी तरह से नियंत्रित शर्तों6,7,8में नहीं किया जाता है । इसके अलावा, rhizosphere-बाधा सूक्ष्मजीवों संयंत्र कोशिका झिल्ली पारगम्यता को प्रभावित करने और जड़ ऊतकों को नुकसान पहुँचाए, विशेष रूप से सूक्ष्मजीवों9के consortia के मामले में जड़ रिसाव रचना को प्रभावित कर सकते हैं । जब रूट exudates के माइक्रोबियल प्रतिक्रिया की जांच, यह अच्छी तरह से परिभाषित शर्तों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है क्रम में अंय सूक्ष्मजीवों10द्वारा यौगिकों के परिवर्तन से बचने के लिए । इसके अलावा, आरएनए-seq आधारित transcriptome अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए की आवश्यकता है । हालांकि, जब गैर से निपटने-मॉडल-बैक्टीरियल उपभेदों, मानक प्रोटोकॉल या वाणिज्यिक किट आमतौर पर एक कम अज्ञात कारकों या विशेष वृद्धि संपत्तियों के कारण दक्षता है ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित बी mycoides, जो एक ग्राम सकारात्मक, बीजाणु है Firmicute जाति के जीवाणु बनाने का उपयोग कर सत्यापित किया गया था । यह विभिन्ना पादप प्रजातियों के rhizosphere में सर्वत्र व्याप्त है. कई संयंत्र विकास के गुणों को बढ़ावा देने के इस प्रजाति के लिए सूचित किया गया है, व्यवस्थित प्रतिरोध की प्रेरण सहित (ISR) में चीनी चुकंदर11, के निषेध-बंद भिगोना रोगज़नक़12ककड़ी के लिए Pythium , साथ ही साथ नाइट्रोजन सूरजमुखी rhizosphere13में निर्धारण । हालांकि, एक मेजबान संयंत्र के साथ अपनी बातचीत के आणविक तंत्र अच्छी तरह से अध्ययन नहीं कर रहे हैं ।
यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों का उद्देश्य आलू की जड़ exudates को endosphere-पृथक बी. mycoides की transcriptomic प्रतिक्रिया का अध्ययन करना है. संक्षेप में, प्रोटोकॉल निंनलिखित चरणों के होते हैं: सबसे पहले, बाँझ शर्तों के तहत आलू जड़ exudates लीजिए । फिर, जड़ exudates के साथ इलाज बैक्टीरियल कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता आरएनए निकालने. अंतिम चरण डेटा विश्लेषण वेब आधारित टी-रेक्स पाइपलाइन14का उपयोग कर रहा है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग B. mycoides जीन पहचानने के लिए किया जाता है जो रूट-exudates के साथ संपर्क पर अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव दिखाते हैं और इस प्रकार पौधे-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत बैक्टीरिया और पौधों के बीच एक पतले देखते संतुलन द्वारा निर्धारित किया जा करने के लिए परिकल्पना की गई है । इस तरह के बातचीत के अत्यधिक जटिल और एक प्राकृतिक प्रणाली है, जो विवि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए Jakob Viel धंयवाद । हम भी bioinformatics विश्लेषण में उनकी मदद के लिए ऐनी डी जोंग धंयवाद । Yanglei यी और Zhibo ली को चीन छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी) द्वारा समर्थित किया गया है । हम Back2Roots को उनके वित्तीय समर्थन के लिए NWO-TTW Perspectief Programma TKI (OPK-AF-१५५१०) का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
Referências
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