Plante-mikrobe samhandling: Transcriptional svar av Bacillus Mycoides potet Root eksudater
Summary
Målet med protokollen presenteres her er å studere transcriptomic svaret av endosphere-isolert Bacillus mycoides potet root eksudater. Denne metoden muliggjør identifikasjon av viktige bakteriell gener involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner og er i prinsippet gjelder for andre endophytes og planter, med mindre justeringer.
Abstract
Fordelaktig plante-assosiert bakterier spiller en viktig rolle i å fremme vekst og forebygge sykdom på planter. Bruk av plante vekst-fremme rhizobacteria (PGPR) som biofertilizers eller biocontrol har blitt et effektivt alternativ til bruk av konvensjonelle gjødsel og kan øke avling produktivitet til lave kostnader. Plante-mikrobe interaksjoner er avhengig av verten anlegget-utskilles signaler og en reaksjon heretter av deres tilknyttede bakterier. Imidlertid reagerer molekylære mekanismer av hvordan gunstige bakterier på deres tilhørende plante-avledet signaler ikke er fullt ut forstått. Vurdere transcriptomic svaret av bakterier root eksudater er en effektiv tilnærming til å finne bakteriell genuttrykk og regulering under rhizospheric forhold. Slik kunnskap er nødvendig for å forstå de underliggende mekanismene som er involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for å studere transcriptomic svar B. mycoides EC18, en stamme isolert fra potet-endosphere til potet root eksudater. Med hjelp av siste høy gjennomstrømming sekvensering teknologi, kan denne protokollen utføres i flere uker og produsere massive datasett. Først samle vi root eksudater under sterile forhold, etter som de legges til B. mycoides kulturer. RNA fra disse kulturene er isolert med en fenol/kloroform metode kombinert med en kommersiell kit og utsatt for kvalitetskontroll av et automatisert geleelektroforese instrument. Etter sekvensering, dataanalyse utføres med webbaserte T-REx rørledningen og en gruppe av ulikt uttrykt gener er identifisert. Denne metoden er et nyttig verktøy for å lette nye funn på bakteriell gener involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner.
Introduction
Planter kan sårvæske opptil 20% av karbon fast under fotosyntese gjennom røttene til rhizosphere1, dvs, smale sonen av jord i nærheten av røttene. Høyere næringsstoffer tilgjengeligheten er rhizosphere en passende beboelse for mangfoldig mikroorganismer, inkludert plantevekst fremme bakterier. Root-eksudater inneholder en rekke uorganiske forbindelser som ioner, uorganisk syrer, oksygen og vann. Men dannes fleste root eksudater av organisk materiale som kan deles inn i lav molekylvekt forbindelser og høy molekylvekt forbindelser. Lav molekylvekt forbindelser inkluderer aminosyrer, organiske syrer, sukker, Fenoliske forbindelser, fettsyrer og en rekke andre metabolitter. Høy molekylvekt forbindelsene består mucilage og proteiner2,3. Rhizosphere mikroorganismer kan bruke noen av disse forbindelsene som energikilde for vekst og utvikling. Root eksudater spiller en viktig rolle i utformingen av rhizobacterial samfunnet siden de plante-produsert forbindelsene i eksudater kan påvirke atferden til rhizosphere-assosiert bakterier ved å påvirke uttrykket av bestemte gener.
Forstå bakteriell svaret root eksudater er et viktig skritt i tyde plante-mikrobe samhandling mekanismer. Bakteriell svaret å plante-mikrobe samhandling er produktet av differensial genuttrykk, kan det bli undersøkt av transcriptome analyse. Bruker denne metoden, identifisert tidligere studier flere viktige gener involvert i anlegget-mikrobe interaksjoner. I Pseudomonas aeruginosa, ble gener involvert i stoffskiftet, chemotaxis og type II sekresjon vist å svare på sukkerroer rot eksudater4. Fan et al. 5 studerte transcriptomic profilering av B. amyloliquefaciens FZB42 svar på mais root eksudater. Resultatene viser at av genene sterkt indusert av root eksudater, flere grupper er involvert i metabolske veier knyttet til næringsstoffer utnyttelse, chemotaxis, motilitet og ikke-ribosomal syntese av antimikrobielle peptider og polyketides.
Nøyaktigheten av disse studiene er avhengig av samlingen av root eksudater. Selv om flere metoder har beskrevet samlingen av root eksudater for ulike formål, de krever avanserte instrument eller utføres ikke i godt kontrollerte forhold6,7,8. Videre rhizosphere begrenser mikroorganismer kan påvirke rot sårvæske komposisjon ved å påvirke plante celle membran permeabilitet og skade rot vev, spesielt når det gjelder konsortier av mikroorganismer9. Når undersøke mikrobiell svaret root eksudater, er det viktig å bruke veldefinerte forhold for å unngå endring av forbindelser med andre mikroorganismer10. Videre er høykvalitets RNA nødvendig for RNA-seq basert transcriptome studier. Men når du arbeider med ikke-modell-bakteriell stammer, har standardprotokoller eller kommersielle kits vanligvis en lav effektivitet på grunn av ukjente faktorer eller spesielle vekst egenskaper.
Protokollen beskrevet her ble bekreftet bruker B. mycoides, som er en gram-positive, spore-forming bakterie av Firmicute-rekken. Det er allestedsnærværende i rhizosphere av forskjellige plantearter. Flere anlegg veksten fremme egenskaper er rapportert for denne arten, inkludert induksjon systematisk motstand (ISR) i sukkerroer11, hemming av demping av patogen Pythium for agurk12, samt nitrogen fiksering i solsikke rhizosphere13. Imidlertid er molekylære mekanismer av dets interaksjon med næringsplante ikke godt studert.
Målet med eksperimenter presenteres her er å studere transcriptomic svaret av endosphere-isolert B. mycoides potet root eksudater. Kort sagt, protokollen består av følgende trinn: først samle potet root eksudater under sterile forhold. Deretter pakker du ut høykvalitets RNA fra bakterieceller behandlet med root eksudater. Det siste trinnet er dataanalyse ved hjelp av den webbaserte T-REx rørledning14. Denne protokollen ble brukt til å identifisere B. mycoides gener som viser et skifte i uttrykket nivåer ved kontakt med root-eksudater og dermed kan spille en viktig rolle i plante-mikrobe interaksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plante-mikrobe interaksjoner har vært hypotese skal bestemmes av en finstemt likevekt mellom bakterier og planter. Slik interaksjon er svært komplisert og vanskelig å studere i et naturlig system som omfatter variert mikrobielle arter, potensielt fungerer som konsortier. Dette dokumentet beskriver en forenklet protokoll for å studere bakteriell svaret root eksudater under godt kontrollerte forhold. Transcriptome profil av rhizobacteria, ved eksponering til root eksudater, gir detaljert informasjon om bakteriell å rh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jakob Viel for hans nyttige kommentarer og forslag. Vi takker også Anne de Jong for hans hjelp bioinformatikk analysen. Yanglei Yi og Zhibo Li støttes av Kina stipend Council (CSC). Vi takker NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) for sin økonomiske støtte til OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
Referências
- Haichar, F. e. Z., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -. H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
