एक एकल Tardigrade नमूना से Ultralow इनपुट जीनोम अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी
Summary
सूक्ष्म जीवों के जीनोमिक अनुक्रमण के दौरान संदूषण एक बड़ी समस्या बनी हुई है । यहां, हम एक विधि दिखाने के लिए एक नमूना से एक tardigrade के जीनोम के रूप में छोटे के रूप में जीनोमिक डीएनए के पूरे जीनोम प्रवर्धन के साथ कम से कम के लिए संदूषण के जोखिम को ंयूनतम ।
Abstract
Tardigrades सूक्ष्म जानवर है कि एक ametabolic राज्य में प्रवेश anhydrobiosis बुलाया जब सुखाना सामना कर रहे है और उनके मूल राज्य में लौट सकते है जब पानी की आपूर्ति की है । इस तरह के tardigrades जोखिम जीवाणु संक्रमण के रूप में सूक्ष्म पशुओं के जीनोमिक अनुक्रमण है कि कई बार गलत व्याख्याओं की ओर जाता है, उदाहरण के लिए, इन पशुओं में क्षैतिज जीन हस्तांतरण की सीमा के बारे में । यहां, हम एक ultralow इनपुट विधि प्रदान करने के लिए tardigrade के जीनोम अनुक्रम, Hypsibius dujardini, एक ही नमूना से । एक एकल व्यक्ति से ५० ~ २०० स्नातकोत्तर जीनोमिक डीएनए के एक कुशल निष्कर्षण के साथ कठोर धुलाई और contaminant अपवर्जन के साथ काम करके, हम एक डीएनए अनुक्रमण साधन के साथ अनुक्रम पुस्तकालय का निर्माण किया । इन पुस्तकालयों अत्यधिक reproducible और निष्पक्ष थे, और अनुक्रम के अंय एच dujardini जीनोम के साथ पढ़ता एक सूचना का विश्लेषण संदूषण की एक ंयूनतम राशि दिखाई । इस विधि unculturable tardigrades कि पिछले विधियों का उपयोग कर अनुक्रम नहीं किया जा सकता करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Tardigrades सूक्ष्म जानवर है कि एक ametabolic जब सुखाना का सामना करना पड़ anhydrobiosis बुलाया राज्य में प्रवेश कर सकते हैं । वे पानी के अवशोषण से ठीक1,2. ametabolic राज्य में, tardigrades विभिन्न चरम वातावरण को सहन करने में सक्षम हैं, जो चरम तापमान3 और दबाव4,5, पराबैंगनी प्रकाश6की एक उच्च खुराक, एक्स-रे, और गामा किरणों शामिल 7 , 8, और ब्रह्मांडीय अंतरिक्ष9। जीनोमिक डेटा anhydrobiosis के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक अपरिहार्य आधार है ।
tardigrades के जीनोम के अनुक्रम के पिछले प्रयास जीवाणु संदूषण10,11, 12,13,14के लक्षण दिखाई दिया है । ऐसे छोटे जीवों से जीनोमिक अनुक्रमण पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है और जीवाणु संक्रमण के लिए प्रवण है; इसलिए, हम पहले tardigrade का एक नमूना से शुरू एक ultralow इनपुट विधि का उपयोग कर,15संदूषणों के जोखिम को कम करने के लिए एक अनुक्रमण प्रोटोकॉल की स्थापना की है । इन आंकड़ों का प्रयोग, हम आगे एक उच्च गुणवत्ता पुनर्अनुक्रमण और एच dujardini16,17के जीनोम के विधानसभा का आयोजन किया है । यहाँ हम विस्तार से एक एकल tardigrade व्यक्ति से जीनोमिक अनुक्रमण के लिए इस विधि का वर्णन (चित्रा 1). इस sequencing विधि की मांयता इस काग़ज़ के फ़ोकस से बाहर है और पहले से ही हमारी पिछली रिपोर्ट16में गहन रूप से चर्चा की गई है ।
इस विधि के दो भागों शामिल है: एक एकल tardigrade के अलगाव संभव सबसे कम संदूषण के साथ, और उच्च गुणवत्ता pictogram डीएनए के स्तर निष्कर्षण । tardigrade भूखे है और पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला, साथ ही साथ एंटीबायोटिक दवाओं, और 500X आवर्धन के साथ एक खुर्दबीन के नीचे मनाया के लिए किसी भी जीवाणु संक्रमण को हटाने सुनिश्चित करते हैं । पिछले अनुमान और माप बताते है कि tardigrade के एक एकल व्यक्ति लगभग ५०-२०० जीनोमिक डीएनए के स्नातकोत्तर16, जो फ्रीज-गल चक्र द्वारा या मैनुअल homogenization द्वारा काइटिन exoskeleton खुर द्वारा निकाला जाता है शामिल हैं । इस जीनोमिक डीएनए पुस्तकालय निर्माण के लिए प्रस्तुत किया है और एक डीएनए अनुक्रमण साधन पर अनुक्रम । एक अतिरिक्त सूचना विश्लेषण उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण, साथ ही पिछले tardigrade अनुक्रमण परियोजनाओं की तुलना में संदूषण के निम्न स्तर से पता चलता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरियल संदूषण सूक्ष्म जीवों के जीनोमिक अनुक्रमण के लिए एक खतरा बन गया है । जबकि tardigrade जीनोम अनुक्रमण पर पिछले अध्ययनों से बाहर फ़िल्टर्ड है व्यापक सूचना के तरीकों का उपयोग कर संदूषण12,<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक नोजोमी अबे, युकी टकै, और Nahoko Ishii जीनोमिक अनुक्रमण में उनके तकनीकी समर्थन के लिए धंयवाद । यह काम अनुदान द्वारा समर्थित था जापान सोसायटी के लिए विज्ञान के संवर्धन के लिए सहायता (JSPS) रिसर्च फेलो, KAKENHI अनुदान में युवा वैज्ञानिकों के लिए सहायता (no. 22681029), और KAKENHI अनुदान में सहायता के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (ख), नहीं, 17H03620 से JSPS, एक सुमितोमो फाउंडेशन (सं. 140340) से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं के लिए अनुदान, और आंशिक रूप से यामागाता प्रीफेक्चुरल सरकार और Tsuruoka शहर, जापान से अनुसंधान निधियों द्वारा । Chlorella tardigrades को खिलाने के लिए प्रयुक्त Chlorella उद्योग कं लिमिटेड के सौजंय से प्रदान किया गया था
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
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