Contaminação durante o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos continua a ser um grande problema. Aqui, nós mostramos um método para sequenciar o genoma de um Tardigrada de um único espécime com tão pouco quanto 50 pg de DNA genômico sem amplificação do genoma inteiro para minimizar o risco de contaminação.
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Artigo de método
Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tardigrades são animais microscópicos que entram em um estado de ametabólico chamado anidrobiose quando enfrenta a dessecação e pode retorna ao seu estado original, quando a água é fornecida. O sequenciamento genômico de animais microscópicos, como tardigrades riscos contaminação bacteriana que às vezes leva a interpretações errôneas, por exemplo, sobre a extensão da transferência horizontal de genes nestes animais. Aqui, nós fornecemos um método de entrada ultralow para sequenciar o genoma da Tardigrada, Hypsibius dujardini, de um único espécime. Empregando a rigorosa exclusão de lavagem e contaminantes juntamente com uma extração eficiente dos 50 ~ 200 pg DNA genômico de um único indivíduo, nós construímos uma biblioteca sequenciada com um instrumento de sequenciamento de DNA. Essas bibliotecas foram altamente reprodutível e imparcial, e uma análise informática das leituras sequenciais com outras genomas de H. dujardini mostrou uma quantidade mínima de contaminação. Esse método pode ser aplicado a tardigrades unculturable que não podem ser sequenciados usando métodos anteriores.
Introdução
Tardigrades são animais microscópicos que podem entrar em um estado de ametabólico chamado anidrobiose, quando enfrenta a dessecação. Eles recuperar pela absorção de água,1,2. No estado ametabólico, tardigrades são capazes de tolerar vários ambientes extremos, incluindo temperaturas extremas pressões e3 4,5, uma dose elevada de luz ultravioleta6, raios-x e raios gama 7 , 8e o espaço cósmico9. Dados genomic são uma base indi....
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Protocolo
1. preparação
- Prepare o gel de agarose 2% usando água destilada (DW) como solvente em um prato de cultura plástico 90 mm e 10 mL de um cocktail com DW 1% penicilina/estreptomicina. O gel pode ser armazenado por 2-3 semanas na incubadora, situado a 18 ° C.
Nota: Evite qualquer armazenamento do gel abaixo de 10 ° C, para a baixa temperatura vai encolher o gel de agarose, resultando em uma minúscula abertura entre o gel e a parede do prato de cultura em que o tardigrades podem ser preso.
2. exclusão de contaminantes e preparação da amostra
- Coletar uma única Tardigrada, colocá-lo na placa de ágar preparado e lavá-lo....
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Resultados
Exclusão de contaminantes:
Este protocolo envolve uma lavagem completa da Tardigrada e uma esterilização com tratamento de antibióticos para minimizar a contaminação. Também envolve um processo de verificação visual para garantir a integridade desses processos. Uma imagem de microscópio durante a validação (passo 2.4 do protocolo) é mostrada na Figura 2. Quando observado em uma ampl.......
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Discussão
Contaminação bacteriana representa uma ameaça para o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos. Enquanto estudos anteriores no sequenciamento do genoma tardigrade tem filtrado contaminação usando métodos de extensa informática12,20, nós sequenciou o genoma de um único indivíduo para minimizar o risco de contaminações. Desde que um indivíduo Tardigrada contém aproximadamente 50-200 pg de DNA genômico16 e é envolto em uma camada e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer Nozomi Abe, Yuki Takai e Nahoko Ishii seu apoio técnico no sequenciamento genômico. Este trabalho foi financiado por subsídio para a sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) Research Fellow, KAKENHI brasileira para jovens cientistas (No.22681029) e KAKENHI brasileira de pesquisa científica (B), n º 17 H 03620 dos JSPS, por um Subsídio para projetos de pesquisa de ciência básica da Fundação Sumitomo (No.140340) e em parte por fundos de pesquisa do governo da província de Yamagata e Tsuruoka City, Japão. Chlorella vulgaris , usado para alimentar os tardigrades foi fornecido cortesia de Chlorella Industry Co. Ltd.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio SZ61 | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicilina Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 Sistema | Keyence | ||
| 0.2mL Tubo de revestimento de silicone | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Kit de micropreparação | ZYMO Research | D3021 | O uso deste kit é absolutamente crítico; consulte a etapa 3.1 |
| 1,5 mL microtubo | greiner bio-one | 616-201 | Veja 4.1.1 |
| Microcentrífuga refrigerada de alta velocidade | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | ||
| Kit ThruPLEX DNA-Seq | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | O uso deste kit é absolutamente crítico; consulte a etapa 4.2 |
| Termociclador | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| Reagente AMPure XP | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Etanol | Wako | 054-027335 | |
| Tampão EB | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagentes | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Tampão/Reagente | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrífuga | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 ciclo v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| Sequenciador MiSeq | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
Referências
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P.
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Reimpressões e permissões
