أثر إينتراكاردياك من الخلايا العصبية في القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس في نظام لانجيندورف السابقين فيفو
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لتحوير intracardiac العصبي اللاإرادي وتقييم تأثيرها على الكهربية الأساسية، أررهيثموجينيسيس، وديناميات المخيم باستخدام إعداد لانجيندورف السابقين فيفو .
Abstract
منذ اختراع لها في القرنال 19 في وقت متأخر، لا يزال نظام التروية السابقين فيفو لانجيندورف القلب لتكون أداة مناسبة لدراسة طائفة واسعة من المعلمات الفسيولوجية والبيوكيميائية والمورفولوجية والدوائية في قلوب دينيرفاتيد مركزياً. هنا، يمكننا وصف إعداد لتحوير intracardiac العصبي اللاإرادي وتقييم تأثيرها على الكهربية الأساسية، أررهيثموجينيسيس، وديناميات دوري الادينوسين الأدينوزين (مخيم). هو عن طريق تشريح الميكانيكية من الدهون أذينية منصات في ganglia مورين التي تقع أساسا التضمين العصبي اللاإرادي intracardiac – أو بواسطة استخدام التدخلات الدوائية العالمية فضلا عن المستهدف. يتم إدخال قسطرة الكهربية أوكتابولار في الاذين الأيمن والبطين الأيمن، وتستخدم صفائف متعدد القطب epicardial وضعها (طيران الشرق الأوسط) لرسم خرائط عالية الدقة لتحديد القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس. يتم تنفيذ نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) تصوير للرصد في الوقت الحقيقي لمستويات المخيمات في مناطق مختلفة من القلب. هو درس نيورومورفولوجي عن طريق القائم على جسم تلطيخ القلوب كلها باستخدام علامات العصبية ليسترشد بها في تحديد الهوية والتحوير لأهداف محددة من الجهاز العصبي اللاإرادي intracardiac في الدراسات المنجزة. الإعداد لانجيندورف السابقين فيفو يسمح لعدد كبير من التجارب استنساخه في فترة زمنية قصيرة. على الرغم من ذلك، الطبيعة المفتوحة جزئيا للإعداد (مثلاً.، خلال قياسات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) يجعل من الصعب التحكم في درجة حرارة ثابتة وينبغي أن يظل الحد أدنى. هذا الأسلوب هو موضح يجعل من الممكن لتحليل وتعدل intracardiac العصبي المستقل في قلوب اللامركزية.
Introduction
لا يزال نظام التروية السابقين فيفو لانجيندورف القلب لتكون أداة مناسبة لأداء مجموعة واسعة من الفسيولوجية والبيوكيميائية والمورفولوجية، والدراسات الدوائية في مركزي دينيرفاتيد القلوب1،2 3، ،،من45 منذ اختراع لها فيال 19 أواخر القرن6. وحتى الآن، ويستخدم هذا النظام على نطاق واسع لمختلف المواضيع (مثلاً.، الاسكيمية ضخه) أو لدراسة القلب الدوائي آثار7،8، وهو أداة أساسية في أبحاث القلب والأوعية الدموية. طول العمر لهذا الأسلوب ينتج من مزايا عديدة (مثلاً.، قياسات تتم دون التأثير الجهاز العصبي المركزي أو أجهزة، والدوران الجهازي، أو هرمونات المتداولة). إذا لزم الأمر، يمكن إضافتها بطريقة الخاضعة للرقابة إلى المخزن المؤقت نضح المستحضرات الصيدلانية أو تطبيقها على هياكل محددة مباشرة. تجارب استنساخه، ويمكن أن يؤديها عدد كبير نسبيا من التجارب في فترة قصيرة من الزمن. يمكن جعل الطبيعة المفتوحة (جزئيا) للإعداد تنظيم درجة الحرارة صعبة وتحتاج إلى أن تؤخذ في الاعتبار. على الرغم من أن النظام لانجيندورف يستخدم أيضا في أكبر الأنواع9، أصغر الحيوانات تستخدم أساسا كالأعداد التجريبية هو أقل تعقيداً، وتغير البيولوجي أكبر (مثلاً.، محوره وراثيا الفأر نماذج) يمكن استخدامها.
في إعداد هذا البروتوكول التجريبي، تأثير النظام العصبي اللاإرادي intracardiac على البارامترات الأساسية للكهربية والبطين أررهيثموجينيسيس والتوصيل ابيكارديال وديناميات دوري الادينوسين الأدينوزين (مخيم) تقييم. عدد كبير من العقد إينتراكاردياك، التي تقع أساسا في منصات الدهون الرجفان، والآن معروفة جيدا لمراقبة القلب الكهربية المستقل من السيطرة العصبية المركزية، أما ترك سليمة أو إزالتها يدوياً بعناية الميكانيكية تشريح. يتم تنفيذ تحوير الدوائي العصبي المستقل أما على الصعيد العالمي عن طريق إضافة المستحضرات الصيدلانية إلى المخزن المؤقت نضح أو محلياً بالتحوير مستهدفة من ganglia أذينية. بعد التجارب، والقلوب أيضا مناسبة لتقييم إيمونوهيستولوجيكال كما تم إزالة جميع خلايا الدم بسبب التروية المستمرة، التي يمكن أن تزيد من نوعية تلطيخ.
الهدف العام لتقنيات وصف عرض منظورات جديدة لدراسات تفصيلية فيما يتعلق بتأثير النظام العصبي اللاإرادي في القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس في قلب الماوس. سببا لاستخدام هذا الأسلوب أنه من الممكن دراسة وتغيير النظام العصبي اللاإرادي دون تأثير الجهاز العصبي المركزي. ميزة واحدة كبرى هي توظيف سهلة للتجارب الدوائية، في المحتملة برو-أو أنتيارهيثميك الخصائص التي القديمة ويمكن اختبار العوامل الجديدة. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر نماذج الماوس المعدلة وراثيا والضربة القاضية لمختلف أمراض القلب للتحقيق في الآليات الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب أو فشل القلب أو الأمراض الأيضية. وعزز هذا النهج فهم كيف يمكن أن يؤثر العصبي المستقل على مستوى أذينية بطيني القلب الكهربية وتنظيم دورات تعريفية لعدم انتظام ضربات القلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد في هذه المخطوطة، المعروفة لانجيندورف السابقين فيفو القلب نضح النظام كأداة لدراسة أثر إينتراكاردياك من الخلايا العصبية في القلب الكهربية وأررهيثموجينيسيس باستخدام رسم الخرائط المختلفة وتقنيات التحفيز بما في ذلك النهج للوفلر وابيكارديال.
عدة أجزاء من البروتوكو?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر ويبولدت هارتويغ لمساعدته التقنية الممتازة، ويوكه “المجهري التصوير مرفق” (أوميف) للجامعة الطبية مركز هامبورغ-ايبندورف لتوفير الدعم والمجاهر. وكان هذا البحث الممولة bythe Förderverein des اونيفرسترن هيرزينترومس هامبورغ أ. ف. ومن دزهك (المركز الألماني لبحوث القلب والأوعية الدموية) [فكز 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
Referências
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
