Vi præsenterer her, en protokol for graduering af de intracardiac autonome nervesystem og vurdering af dens indflydelse på grundlæggende Elektrofysiologi, arrhythmogenesis og cAMP dynamics ved hjælp af en ex vivo Langendorff opsætning.
Siden sin opfindelse i den sent 19th century fortsætter Langendorff ex vivo hjerte perfusion systemet med at være et relevant værktøj til at studere et bredt spektrum af fysiologiske, biokemiske, morfologiske og farmakologiske parametre i centralt denerveres hjerter. Her, beskriver vi en opsætning for graduering af de intracardiac autonome nervesystem og vurdering af dens indflydelse på grundlæggende Elektrofysiologi, arrhythmogenesis og cyklisk adenosin fra (cAMP) dynamics. De intracardiac autonome nervesystem er moduleret af mekaniske dissektion af atrieflimren fedt puder-i hvilken murine ganglier er placeret primært — eller ved brug af globale samt målrettede farmakologiske interventioner. En octapolar elektrofysiologiske kateter føres ind i højre atrium og højre hjertekammer, og epikardielle placeret multi elektrode arrays (MEA) til høj opløsning tilknytning bruges til at bestemme hjertets Elektrofysiologi og arrhythmogenesis. Förster resonans energioverførsel (FRET) imaging udføres for realtidsovervågning af cAMP niveauer i forskellige kardiale regioner. Neuromorphology er undersøgt ved hjælp af antistof-baserede farvning af hele hjerter ved hjælp af neuronal markører til at guide identifikationen og graduering af specifikke mål for de intracardiac autonome nervesystem i de udførte undersøgelser. Ex vivo Langendorff opsætning giver mulighed for et stort antal reproducerbare eksperimenter i en kort tid. Ikke desto mindre, den delvis åben karakter af opsætningen (fx., under MEA målinger) vanskeliggør konstant temperaturkontrol og bør holdes på et minimum. Denne beskrevne metode gør det muligt at analysere og modulere intracardiac autonome nervesystem i decentrale hjerter.
Langendorff ex vivo hjerte perfusion systemet fortsætter med at være et relevant værktøj til at udføre et bredt spektrum af fysiologiske, biokemiske, morfologiske, og farmakologiske undersøgelser i centralt denerveres hjerter1,2 ,3,4,5 siden sin opfindelse i den sent 19th century6. Til dato, dette system er stadig meget udbredt til forskellige emner (fx., iskæmi reperfusion) eller til at undersøge hjertets farmakologiske effekter7,8, og er et grundlæggende redskab i hjerte-kar-forskning. Levetiden for denne metode resultater fra flere fordele (fx., målingerne udføres uden påvirkning af centralnervesystemet eller andre organer, systemisk cirkulation eller cirkulerende hormoner). Hvis det er nødvendigt, kan lægemidler tilføjes på en kontrolleret måde perfusion buffer eller anvendes til specifikke strukturer direkte. Eksperimenter er reproducerbare, og et relativt stort antal eksperimenter kan udføres i en kort periode. Den (delvis) åbne karakter af opsætningen kan gøre temperaturregulering vanskelig og skal tages i betragtning. Selv om ordningen Langendorff bruges også i større arter9, mindre dyr anvendes primært som eksperimentelle opsætningen er mindre kompleks, og en større biologisk variation (fx., Transgene mus modeller) kan bruges.
De intracardiac autonome nervesystem indflydelse på elektrofysiologiske grundparametre, ventrikulær arrhythmogenesis, epikardielle varmeledning og cyklisk adenosin fra (cAMP) dynamics er i eksperimentel opsætning af denne protokol, evalueret. Et stort antal intracardiac ganglier, som fortrinsvis findes i de atriale fedtpuder, og er nu kendt at kontrollere hjerte Elektrofysiologi uafhængigt af central neural kontrol er enten efterladt intakt eller manuelt fjernet med omhyggelig mekanisk dissektion. En farmakologisk graduering af det autonome nervesystem er udført enten globalt ved at tilføje pharmaceuticals perfusion buffer, eller lokalt af målrettede graduering af de atriale ganglier. Efter forsøgene er hjerterne velegnet til en immunohistological vurdering som alle blodlegemer er blevet fjernet på grund af den kontinuerlige perfusion, som kan øge kvaliteten af farvning.
Det overordnede mål med de beskrevne teknikker er at tilbyde nye perspektiver for detaljerede undersøgelser vedrørende virkningen af det autonome nervesystem på hjerte Elektrofysiologi og arrhythmogenesis i mus hjerte. En grund til at bruge denne teknik er, at det er muligt at undersøge og ændre det autonome nervesystem uden virkningen af det centrale nervesystem. En væsentlig fordel er let beskæftigelse af farmakologiske forsøg, i hvilke potentielle pro- eller antiarytmiske egenskaber af gamle og nye agenser kan testes. Derudover er transgene og knockout musemodeller af forskellige hjerte sygdomme til rådighed til at efterforske de mekanismer, der ligger under arytmier, hjertesvigt eller metaboliske sygdomme. Denne tilgang har forbedret vores forståelse af, hvordan det autonome nervesystem på niveauet atrieflimren kan påvirke ventrikulær hjerte Elektrofysiologi og induktion af arytmier.
I dette manuskript, er den velkendte Langendorff ex vivo hjerte perfusion system præsenteret som et redskab til at undersøge virkningen af intracardiac neuroner på hjerte Elektrofysiologi og arrhythmogenesis ved hjælp af forskellige kortlægning og stimulation teknikker herunder endokardial og epikardielle tilgange.
Flere dele af protokollen er afgørende for opsætningen. For det første er det vigtigt at bruge en forberedelse teknik hvor de atriale fedtpuder forblive intakt elle…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Hartwig Wieboldt for hans fremragende teknisk bistand og UKE mikroskopi Imaging anlægget (Umif) af University Medical Center Hamburg-Eppendorf mikroskoper og støtte. Denne forskning blev finansieret som Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamborg e.V. og af DZHK (tyske Center for hjerte-kar-forskning) [FKZ 81Z4710141].
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |