Impacto de las neuronas intracardiacas sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis en un sistema de Langendorff Ex Vivo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la modulación del sistema de nervioso autónomo intracardiaca y la evaluación de su influencia en la electrofisiología básica, arritmogénesis y campo dinámica utilizando una configuración de Langendorff ex vivo .
Abstract
Desde su invención en los finalesdel siglo 19, continúa siendo una herramienta relevante para el estudio de un amplio espectro de parámetros fisiológicos, bioquímicos, morfológicos y farmacológicos en el sistema de Langendorff ex vivo de la perfusión del corazón corazón denervado centralmente. Aquí, describimos una configuración para la modulación del sistema de nervioso autónomo intracardiaca y la evaluación de su influencia en la dinámica de monofosfato de adenosina cíclico (campo), electrofisiología básica y arritmogénesis. Intracardiaco sistema nervioso autónomo es modulado por la disección mecánica de la grasa pastillas en que ganglios murinos se encuentran principalmente, o por el uso de las intervenciones farmacológicas globales como específicas. Un catéter electrofisiológicos octapolar se introduce en la aurícula derecha y el ventrículo derecho y epicárdico colocados electrodos múltiples arreglos de discos (MEA) para la cartografía de alta resolución se utilizan para determinar la arritmogénesis y electrofisiología cardíaca. Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) proyección de imagen se realiza el monitoreo en tiempo real de los niveles de campo en diferentes regiones cardiacas. Neuromorfología se estudia mediante basados en anticuerpos tinción de corazones enteros utilizando marcadores neuronales para guiar la identificación y la modulación de los objetivos específicos del sistema de nervioso autónomo intracardiaco en los estudios realizados. La configuración de Langendorff ex vivo permite un gran número de experimentos reproducibles en poco tiempo. Sin embargo, la naturaleza en parte abierta de la configuración (por ej., durante las mediciones de MEA) dificulta el control de temperatura constante y debe mantenerse al mínimo. Este método descrito es posible analizar y modular intracardiaco sistema nervioso autónomo en corazones descentralizada.
Introduction
El sistema de Langendorff ex vivo de la perfusión del corazón sigue siendo una herramienta relevante para la realización de un amplio espectro de fisiológicos, bioquímicos, morfológicos, y los estudios farmacológicos en forma centralizada denervado corazones1,2 ,3,4,5 desde su invención en los finales del siglo 19 deth 6. Hasta la fecha, este sistema sigue siendo ampliamente utilizado para diversos temas (por ej., isquemia reperfusión) o estudiar cardiaca farmacológica efectos7,8y es una herramienta básica en la investigación cardiovascular. La longevidad de este método resulta de varias ventajas (por ej., las mediciones se realizan sin la influencia del sistema nervioso central u órganos, circulación sistémica o circulación de las hormonas). Si es necesario, productos farmacéuticos pueden agregar en forma controlada al buffer de perfusión o aplicados a estructuras específicas directamente. Los experimentos son reproducibles, y un número relativamente alto de experimentos se puede realizar en un corto período de tiempo. El carácter abierto (en parte) de la configuración puede hacer difícil regular la temperatura y debe tenerse en cuenta. Aunque el sistema de Langendorff también se utiliza en grandes especies9, animales más pequeños se utilizan sobre todo como el montaje experimental es menos complejo y una mayor variabilidad biológica (e.g., transgénicos modelos del ratón) puede ser utilizado.
En la configuración experimental de este protocolo, la influencia del intracardiaco sistema nervioso autónomo en parámetros electrofisiológicos básicos, arritmogénesis ventricular, epicárdica conducción y dinámica del monofosfato de adenosina cíclico (campo) es evaluados. Un gran número de ganglios intracardiacos, que se encuentran principalmente en los cojines gordos atriales y ahora son bien conocidos para el control de electrofisiología cardíaca independiente de control neural central, son que ya sea a la izquierda intacto o quitado manualmente con cuidado mecánico disección. Una modulación farmacológica del sistema nervioso autónomo se realiza globalmente mediante la adición de productos farmacéuticos en el búfer de perfusión o localmente por la modulación específica de los ganglios auriculares. Después de los experimentos, los corazones son muy adecuados para una evaluación immunohistological como se han eliminado todas las células de la sangre debido a la perfusión continua, que puede aumentar la calidad de la coloración.
El objetivo general de las técnicas descritas es ofrecer nuevas perspectivas de estudios detallados sobre el impacto del sistema nervioso autónomo sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis en el corazón de ratón. Una razón para utilizar esta técnica es que es posible estudiar y alterar el sistema nervioso autónomo sin el impacto del sistema nervioso central. Una ventaja importante es el fácil empleo de experimentos farmacológicos, en que pro – o antiarrítmico propiedades potenciales de viejos y nuevos agentes pueden ser probados. Además, modelos con ratones transgénicos y knockout de diversas enfermedades cardiacas están disponibles para investigar los mecanismos subyacentes de arritmias, insuficiencia cardíaca o enfermedades metabólicas. Este enfoque ha mejorado nuestra comprensión de cómo pueden afectar el sistema nervioso autónomo en el nivel atrial ventricular electrofisiología cardíaca y la inducción de arritmias.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, el Langendorff conocido ex vivo sistema de perfusión del corazón se presenta como una herramienta para estudiar el impacto de las neuronas intracardiacas sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis utilizando diferentes mapas y técnicas de estimulación incluyendo enfoques endocárdicos y epicárdicos.
Varias partes del protocolo son cruciales para la configuración. En primer lugar, es importante utilizar una técnica de preparación en la que los c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Hartwig Wieboldt por su excelente asistencia técnica y el UKE microscopía de imágenes instalación (Umif) del Universidad Medical Center Hamburg-Eppendorf para microscopios y apoyo. Esta investigación fue financiada bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. y el DZHK (centro alemán de Investigación Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
Referências
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
