Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

Summary

Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.

Abstract

Le poulet embryonnaire est couramment utilisé comme un organisme modèle fiable pour le développement des vertébrés. Son accessibilité et son incubation courte période le rend idéal pour l’expérimentation. Actuellement, l’étude de ces voies de développement de l’embryon de poulet est réalisée en appliquant des inhibiteurs et des médicaments à des sites localisés et à de faibles concentrations en utilisant une variété de méthodes. Culture de tissus in vitro est une technique qui permet l’étude des tissus séparés de l’organisme hôte, tout en contournant en même temps beaucoup de limitations physiques présentes lorsque vous travaillez avec des embryons entiers, tels que la susceptibilité des embryons doses élevées de produits chimiques potentiellement mortels. Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver le poulet embryonnaire demi tête in vitro, qui présente de nouvelles opportunités pour l’examen des processus de développement au-delà des méthodes actuellement établies.

Introduction

L’embryonnaire poulet (Gallus gallus) est un organisme d’excellent modèle couramment utilisé dans le domaine de la biologie. Sa période d’incubation est d’environ 21 jours et beaucoup d’oeufs peut être incubés simultanément, rendant les expérimentation rapide et efficace. Peut-être plus important encore, l’embryon est également facilement manipulé, permettant l’étude approfondie des principaux processus de développement et des gènes et des protéines qui animent ces processus.

L’oeil de l’embryon de poulet est un organe complexe qui se développe par l’interaction d’un certain nombre de différents tissus semblables à beaucoup d’autres systèmes de corps. Cette méthode permet l’étude de l’évolution de ces tissus, en particulier à un stade avancé de développement. Par exemple, la rétine multicouche peut être particulièrement intéressante pour ceux qui étudient le développement du système nerveux. Des méthodes alternatives qui permettent l’étude des autres tissus de l’oeil comme la cornée, le corps vitréennes, la lentille, la sclérotique et les paupières sont bénéfiques pour les chercheurs. L’oeil embryonnaire de poulet contient également une série d’os plats, les osselets sclérales, qui peuvent servir de modèle pour l’étude des os intramembranaires induction et l’ossification en vertébrés¹.

Actuellement, il existe un certain nombre de méthodes utilisées pour étudier le développement embryonnaire. Microinjections d’anticorps inhibiteurs ou autres molécules inhibitrices de la^2,3, implanté chirurgicalement des microbilles imbibé d’inhibiteur⁴et électroporation⁵ sont toutes des méthodes pouvant servir à des gènes régulent ou protéines d’intérêt dans un embryon. Des méthodes similaires sont utilisés pour réguler positivement les protéines. Ces méthodes ne sont pas sans leurs limites. Par exemple, lors de l’utilisation de produits chimiques pour modifier le développement embryonnaire, l’effet létal sur l’embryon doit être évalué, et cela limite l’utilisation des méthodes susmentionnées pour les sites localisés d’application à des doses suffisamment bas pour assurer la survie de la embryon.

Culture de tissus in vitro a été utilisée dans un large éventail d’organismes pour étudier le développement et peut être utilisé pour contourner les limitations susmentionnées. Par exemple, les fémurs⁶et plume bourgeons^7,8branches⁹ du poulet ont tous étudiés à l’aide de tissus cultivant des méthodes, comme ont les testicules des souris¹⁰ et les racines et les tiges des plantes¹¹. Ces méthodes accordent aux scientifiques un degré élevé de contrôle sur le développement des tissus, comme la possibilité de varier la température et de modifier la disponibilité des nutriments. L’isolement des tissus de l’embryon entier rend également beaucoup moins sensibles à l’effet létal des produits chimiques, permettant ainsi à des études de manipulation à l’échelle mondiale à des concentrations plus élevées. Un autre avantage notable de la mise en culture in vitro est la préservation de l’environnement cellulaire du tissu ; l’arrangement des tissus reste relativement inchangée, ce qui permet d’étudier les interactions entre les différents tissus types⁹. Ainsi, in vitro culture ouvre portes supplémentaires expérimentale approches non disponible dans des modèles in vivo ou in ovo .

Actuellement, il est particulièrement difficile d’étudier l’évolution de le œil de poulet embryonnaire à l’aide de produits chimiques. Un certain nombre de membranes extra-embryonnaires couvre l’embryon, rendant difficile l’application de microbilles ou produits chimiques ; l’embryon est également très active dans l’oeuf comme elle vieillit, ce qui complique une méthode déjà difficile. Ce protocole permet un accès facile à le œil et des tissus entourant, en éliminant ces obstacles, tout en offrant de nouvelles possibilités d’examiner les processus de développement intérieur de le œil. Ce protocole a été créé pour étudier l’induction des osselets sclérales intérieur de l’oeil embryonnaire.

Protocol

Remarque : Pour les stades de l’embryon, utiliser le Hamburger et Hamilton12 (HH) mise en scène de table. 1. embryon Incubation Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur stérile, contrôle de la température à 37 ° C ± 1 ° C et environ 40 % d’humidité. Tournez les oeufs 1 x par jour et laisser incuber à HH34 (fécondation après 8 jours). 2. préparation et stérilisation du matériel <o…

Representative Results

En utilisant cette méthode, un oeil embryonnaire de poulet peut être cultivé de jour 8 de son développement (HH34) in vitro pendant 4 jours. Quatre jours de in ovo développement correspond à HH38. Cette méthode de culture soutient le développement des bourgeons de plumes autour de le œil et des paupières (Figure 1 b). Ces bourgeons de plumes ne sont pas présents dans…

Discussion

Ce protocole utilise des tissus établie des techniques de culture pour atteindre la croissance d’un oeil de poulet embryonnaire jour 8 (HH34) in vitro pendant 4 jours. Cette méthode de mise en réseau-culture a été initialement décrite par Trowell¹⁵. Nous avons optimisé un protocole de Pinto et Hall 1991 étude¹⁶ utilisant une membrane semi poreuse avec le réseau pour étudier les signaux inductifs entre les couches de tissus séparés des yeux embryonnair…

Materials

35 mm cell culture petri dishes	Corning	353001	easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
100 mm cell culture petri dishes	Corning	353003	tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
paper tissue	Kimtech	34155	Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton
wire mesh	n/a	n/a	stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)
disposable glass pipettes	VWR	14673-010	Borosilicate glass disposable 5 3/4"
nutrient medium	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)
penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised
filter paper	Whatman	1454 090	semi-porous filter paper 90mm
fertilized chicken eggs	Dalhousie University Agricultural College	n/a	can be obtained from local farms
sodium chloride (NaCl)	EMD	SX0420-3	sodium chloride crystals, reagent grade
1 L glass bottle	VWR	89000-240	1 L pyrex autoclavable glass bottle
ethanol	Fisher Scientific	BP82011	70% molecular biology grade
tupperware containers	n/a	n/a	store-bought and sterilized with EtOH
disposable razor blades	VWR	55411-050	single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)
plastic spoons	n/a	n/a	store-bought and sterilized with EtOH
dust mask	3M	n/a	3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	paraformaldehyde, reagent grade, crystalline
neutral-buffered formalin	Fisher Scientific	72210	10% neutral buffered formalin
phosphate buffered saline (PBS)	n/a	n/a	10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes	VWR	21008-216	presterilized centrifuge tubes
forceps	FST	n/a	fine forceps
chick saline	n/a	n/a	0.85% NaCl
tinfoil	n/a	n/a	store-bought
paper towel	n/a	n/a	store-bought