Fristående elektrokemiska uppställning att berika anod-respiring bakterier på plats
Summary
På plats mikrobiell anrikning eller i situ odlingsteknik kan underlätta isolering av svårt-att-kultur mikrobiell taxa, särskilt från låg-biomassa eller geochemically extrema miljöer. Här beskriver vi ett elektrokemiska uppställning utan att använda en extern strömkälla för att berika mikrobiell stammar som klarar av extracellulära elektrontransport (EET).
Abstract
Anaerob respiration tillsammans med elektrontransport till olösliga mineraler (kallad extracellulär elektrontransport [EET]) tros vara kritiska för mikrobiell energiproduktion och persistens i många subsurface miljöer, särskilt de saknas lösliga terminal Elektronacceptorer. Medan EET-kapabla mikrober har framgångsrikt isolerad från olika miljöer, mångfalden av bakterier kan EET är fortfarande dåligt förstått, särskilt i svåra till prov, låg energi eller extrema miljöer, såsom många under ytan ekosystem. Här beskriver vi ett Hotellets elektrokemiska system för att berika EET-kapabla bakterier med en anod som en respiratorisk terminal Elektronacceptor. Detta anoden är ansluten till en katod kan katalysera abiotiska syre minskning. Jämföra detta synsätt med electrocultivation metoder som använder en potentiostat för poising den potentiella elektroden, kräver två-elektrod systemet inte en extern strömkälla. Vi presenterar ett exempel på vår egen berikning som utnyttjas i en alkalisk damm på Cedars, ett marksänd serpentinization plats i norra Kalifornien. Tidigare försök odla mineral minska bakterier var mislyckade, som sannolikt på grund av låg-biomassa arten av denna webbplats eller det låga relativa överflödet av metall minska mikrober. Innan vi genomför vår två-elektrod anrikning, mätte vi den vertikala profilen för koncentrationen upplöst syrgas. Detta tillät oss att placera kolet känt mig anod- och platinum-elektropläteras kol kände katoden på djup som skulle stödja anaeroba och aeroba processer, respektive. Efter Hotellets inkubation, vi ytterligare berikad anodisk elektroden i laboratoriet och bekräftade en distinkt mikrobiell gemenskap jämfört med de surface-anslutna eller biofilm samhällen normalt observerades vid Cedars. Denna berikning som senare ledde till isolering av de första electrogenic mikroben från Cedars. Denna metod för hotellets mikrobiell anrikning har potential att kraftigt öka isoleringen av EET-kapabla bakterier från låg biomassa eller svårt att provet livsmiljöer.
Introduction
Flera mineral-reducerande mikrober har visat att utnyttja fasta fasen mineraler som terminal Elektronacceptorer, av extracellulära elektrontransport (EET) processer som genomföra elektroner till utsidan av cellen via redox enzymer1. OTTAN är avgörande, inte bara för mikrob-mineral processer men också tillämpad energi och miljöteknik, såsom mikrobiella bränsleceller2, elektrod syntes3och bioremediering4. Nya EET-kapabla bakterier är mycket eftertraktade, och har studerats från en grundläggande eller tillämpad perspektiv5. Dock har vi endast begränsad inblick i ekologiska eller biogeokemiska betydelsen av dessa bakterier. Majoriteten av EET-kapabla mikrober har isolerad efter berikning från aqua, sediment eller anaerob kokare med solid Elektronacceptorer t.ex MnO2, Fe2O3 eller redo elektroder i laboratoriet6, 7 , 8. dock dessa metoder ofta producera liknande konsortier och potentiellt missar känsligare taxonomiska enheter som får dominera låg energi eller låg biomassa system, förspänns dessa mikrober förmåga att anpassa sig till lab eller axenic kultur miljö9 . Oftast för låg biomassa miljöer filtreras stora mängder vatten från en webbplats för att koncentrera bakterieceller. Dock EET-kapabla bakterier uppvisar ofta anaerobic ämnesomsättning och därför syrgasexponeringen kan ytterligare hämma eller förhindra deras odling. Alternativa Hotellets metoder att koncentrera celler utan att utsätta dem för syre kan underlätta isolering av EET-kapabla bakterier. Här rapporterar vi Inställningsdetaljer för en Hotellets elektrokemiska teknik att berika EET-kapabla mikrob under en lång tid utan att behöva en extern strömkälla.
Med hjälp av vår electrocultivation experiment från en starkt alkaliska våren i norra Kalifornien, Cedars-10, beskriver vi denna Hotellets elektrokemiska teknik. Geokemi av fjädrar på The Cedars påverkas av serpentinization i markytan. Fjädrarna är mycket reduktiv, med syrehalter under detektionsgränsen under luft vatten gränssnitt belyser risken för mikrobiell energiproduktion via EET i denna funktionellt syrefria miljön11. Det finns dock inga belägg som stödjer EET-kapabla mikrober från Cedars (i antingen 16S rRNA eller gjorts analys). Även om denna miljö har karaktäriserats som Elektronacceptor begränsad, potentialen för att använda olösliga mineraler som terminal Elektronacceptorer, inklusive mineraler såsom järn blottar mineraler som resulterar från serpentinization (dvs. magnetit), har inte varit i stor utsträckning undersökta12. Vi, distribuerat därför vårt elektrokemiska system på campingen Spring, en högt pH fjädrar på Cedars, att berika för EET-kapabla mikrober (figur1)13.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den beskrivna studien visar vi berikning av en mikrobiell konsortium, kopplade i situ nuvarande produktion. Observerade mönstren i nuvarande stöd mikrobiell aktivitet i detta system med korta och långa tiden skalar. Det kritiska steget för att konstruera ett funktionellt två-elektrod (bränslecell typ) system är att identifiera och utnyttja ett läge med en stabil vattennivå och syrekoncentrationen i miljön. Katoden utsätts för syre vid luft vatten gränssnittet, medan anoden hålls under anaeroba f?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi skulle vilja erkänna Roger Raiche och David McCrory för ger oss tillgång till Cedars och samråd på platser för lång sikt inkubation. Vi tackar också Cedars fältet besättningen under säsongen 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam och Matthew Schechter. Ytterligare tack vare Shino Suzuki och Gijs Kuenen för insiktsfulla forskning och odlingsskålar stöd. Detta arbete finansierades genom ett bidrag för unga forskare A och B från Japan sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS) KAKENHI Grant nummer 17H 04969 och 26810085, respektive, och Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling (17gm6010002h0002). USA: S finansiering som tillhandahålls av oss Office av globala Naval forskningen (N62909-17-1-2038), och centrum för mörk energi biosfären utredningar (C-DEBI) (OCE0939564) och NASA Astrobiology Institute – liv Underground (NAI-LU) (NNA13AA92A). Del av detta arbete genomfördes som en del av en Japan samhälle för befordran av vetenskaperna: kortsiktiga postdoktorsstipendium för Annette Rowe (PE15019) vid University of Tokyo i labbet av Kazuhito Hashimoto.
Materials
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
Referências
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).
- Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis – revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).
- Lovley, D. R., Coates, J. D. Bioremediation of metal contamination. Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).
- Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200. Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).
- Rowe, A. R., et al. In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring. Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).
- Suzuki, S., et al. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).
- Suzuki, S., et al. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communications. 5, 3900 (2014).
- McCollom, T. M., et al. Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine. Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).
- Morrill, P. L., et al. Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars. Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. . Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells. , 207-222 (2012).
- Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier. Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).
