Här presenterar vi verktyget proteogenomic PoGo och protokoll för snabb, kvantitativa, posttranslationella modifieringen och variant aktiverad mappning av peptider som identifieras genom masspektrometri på referens genomen. Detta verktyg är att integrera och visualisera proteogenomic och personliga proteomiska studier samverkar med ortogonala genomik data.
Överhörning mellan gener, avskrifter och proteiner är nyckeln till cellulära svar; analys av molekylära nivåer som skilda enheter utökas därför långsamt till integrativ studier för att förbättra förståelsen av molekylär dynamik inom celler. Aktuella verktyg för visualisering och integrering av proteomik med andra omics datauppsättningar är otillräckliga för storskaliga studier. Dessutom de bara fånga grundläggande sekvens identifiera, kasta post-translationella modifieringar och kvantifiering. För att lösa problemen, utvecklat vi PoGo mappa peptider med associerade post-translationella modifieringar och kvantifiering vill referera genomet anteckning. Dessutom utvecklades verktyget för att aktivera Mappning av peptider som identifierats från anpassad sekvens databaser införliva enda aminosyra varianter. PoGo är en befalla lina redskap, det grafiska gränssnittet PoGoGUI kan icke-bioinformatik forskare enkelt mappa peptider till 25 arter stöds av häckning genomet anteckning. Genererade utdata lånar format från fältet genomik och visualisering stöds därför i de flesta genomet webbläsare. För storskaliga studier stöds PoGo av TrackHubGenerator att skapa webb-tillgång förråd av data mappas till genomen som också möjliggör en enkel delning av proteogenomics data. Med lite ansträngning, kan detta verktyg karta miljontals peptider vill referera genomen inom bara några minuter, överträffar andra tillgängliga sekvens-identitet baserat verktyg. Detta protokoll visar de bästa metoderna för proteogenomics kartläggning genom PoGo med allmänt tillgängliga datauppsättningar av kvantitativa och phosphoproteomics, samt storskaliga studier.
I celler påverkar genomet, transkriptom och proteomet varandra för att modulera ett svar till interna och externa stimuli och interagerar med varandra för att utföra specifika funktioner leder till hälsa och sjukdom. Därför, karakterisera och kvantifiera gener, avskrifter och proteiner är avgörande för att fullt förstå cellulära processer. Nästa generations sekvensering (NGS) är en av de vanligaste tillämpad strategierna att identifiera och kvantifiera genen och avskrift uttryck. Proteinuttryck bedöms dock vanligen av masspektrometri (MS). Betydande framsteg inom MS teknik under det senaste decenniet har möjliggjort mer en fullständig identifiering och kvantifiering av Proteom, göra uppgifterna som är jämförbara med transkriptomik1. Proteogenomics och multi-omics som sätt att integrera NGS och MS data har blivit kraftfulla metoder för att bedöma cellulära processer över flera molekylära nivåer, att identifiera subtyper av cancer och leder till nya potentiella målmolekyler i cancer2 , 3. det är viktigt att notera att proteogenomics användes ursprungligen proteomiska underlag för gen- och avskrift anteckningar4. Flera gener som tidigare trodde var icke-kodande har nyligen genomgått omvärdering överväger storskaliga mänsklig vävnad datamängder5,6,7. Dessutom används proteomiska data framgångsrikt för att stödja insatser för anteckning i icke-modellorganismer8,9. Dock proteogenomic dataintegration kan utnyttjas utöver höjdpunkt proteinuttryck i förhållande till genomisk funktioner och belysa överhörning mellan avskrifter och proteiner genom att ge en kombinerad referenssystem och metoder för samtidig visualisering.
För att ge en gemensam referens för proteomik och transkriptomik genomik data har har många verktyg genomförts för mappning peptider identifieras genom MS på genomet koordinater10,11,12 ,13,14,15,16,17. Metoder har olika aspekter såsom kartläggning referens, stöd av genomet webbläsare och graden av integration med andra proteomik verktyg som visas i figur 1. Medan vissa verktyg karta omvänd översatta peptider på en genomet16, använder andra en sökmotor annotated position inom ett protein och gen anteckning för att rekonstruera av nukleotidsekvensen av peptid15. Fortfarande använder andra en 3 – eller 6-bildruta översättning av genomet för att mappa peptider mot11,13. Slutligen, flera verktyg hoppa över nukleotidsekvenser och använda aminosyra sekvens översättningar från RNA-sekvensering mappas avskrifter som intermediär mappa peptider till den associera genomet koordinater10,12, 14,17. Men översättningen av nukleotidsekvenser är en långsam process och anpassade databaser är benägna att fel som propagerar i peptid-mappningen. För snabb och hög genomströmning kartläggning är en liten och omfattande referens avgörande. En standardiserad protein referens med associerade genomet koordinater är därför nödvändig för korrekt peptid genomet-mappningen. Nya aspekter i proteogenomics, såsom införlivandet av varianter och post-translationella modifieringar (PTMs)2,3, fart genom senaste studier. Dock stöds dessa generellt inte av nuvarande proteogenomic kartläggning verktyg som visas i figur 1. För att förbättra hastighet och kvalitet av kartläggning, utvecklades PoGo, ett verktyg som tillåter snabb och kvantitativa kartläggningen av peptider till genomen18. Dessutom möjliggör PoGo kartläggning av peptider med upp till två sekvens varianter och kommenterad post-translationella modifieringar.
PoGo har utvecklats för att klara den snabba ökningen av kvantitativa högupplösta datamängder fånga proteom och globala ändringar och erbjuder ett centralt verktyg för storskaliga analyser såsom personlig variation och precision medicin. Denna artikel beskriver tillämpningen av detta verktyg att visualisera förekomsten av posttranslationella modifieringen i förhållande till genomisk funktioner. Denna artikel belyser dessutom identifiering av alternativ splitsning händelser genom mappade peptider och kartläggning av peptider som identifieras genom anpassade variant databaser till en referens genomet. Detta protokoll sysselsätter offentligt tillgängliga datauppsättningar hämtas från PRIDE arkiv19 att demonstrera dessa funktioner av PoGo. Dessutom beskriver det här protokollet tillämpningen av TrackHubGenerator för att skapa online tillgänglig nav av peptider som mappas till genomen för storskalig proteogenomics studier.
Det här protokollet beskriver hur programvaruverktyget PoGo och dess grafiska användargränssnitt PoGoGUI aktiverar en snabb kartläggning av peptider till genomet koordinater. Verktyget erbjuder unika funktioner som kvantitativa, posttranslationella modifieringen och variant-aktiverad mappning till genomen använda hänvisningen anteckningen. Denna artikel visar metoden på en storskalig proteogenomic studie och belyser dess hastighet och minne effektivitet jämfört med andra tillgängliga verktyg18. I kombination med verktyget TrackHubGenerator, vilket skapar online tillgänglig nav av genomisk och genomet länkade data, PoGo, med dess grafiska användargränssnitt, möjliggör storskalig proteogenomics studier att snabbt visualisera sina data i genomisk sammanhang. Vi visar dessutom de unika funktionerna för PoGo med datamängder som sökte mot variant databaser och kvantitativa phosphoproteomics22,29.
Enstaka filer, såsom GCT filen, ge värdefulla visualisering och länkar mellan peptid funktioner och genomisk loci. Det är dock viktigt att notera att en tolkning utifrån dessa ensam kan vara svårt eller missvisande på grund av deras begränsning till enstaka aspekter av proteogenomics som unika, post-translationella modifieringar och kvantitativa värden. Det är därför viktigt att noga välja vilka utdatafiler, alternativ och kombinationer är lämpliga för proteogenomic fråga till hands och ändra kombinationerna. Exempelvis kan information om unikheten i mappningen till en specifik genomisk locus vara av stort värde för annotering av arvsmassans funktion7, medan kvantifiering över olika prover kan vara mer lämpliga för studier rörande genomisk funktioner till förändringar i protein överflöd29. Utdata ska genereras av PoGo för varje inställning. Om inga utdata genereras, eller tomma filer visas i utdatamappen, rekommenderas det att kontrollera indatafilerna för önskat innehåll och formatet krävs. I fall där filformat eller innehåll inte följer förväntningarna som PoGo (t.ex., den FASTA fil som förmodligen innehåller avskrift översättning sekvenser innehåller nukleotidsekvenser av avskrifter), felmeddelanden kommer att be användaren att Kontrollera indatafilerna.
Begränsningar i protokollet och verktyget är mestadels baserade på återanvändning av format som vanligen används i genomik. Återanvända format som används i genomik för proteogenomic program åtföljs av särskilda begränsningar. Dessa beror på de olika uppsättningarna av kraven för genomet centrerad visualisering av genomisk och proteogenomic data, till exempel behovet av att visualisera post-translationella modifieringar från proteomik data. Detta begränsas i genomik filformat av enstaka geoobjekt användning. Många metoder och verktyg har utvecklats för proteomik för att tryggt lokalisera post-translationella modifieringar inom peptid sekvenser31,32,33,34. Dock hindras visualisering av flera ändringar i en unik och märkbara sätt på genomet av strukturera av genomisk format. Därför den enda block visualiseringen av flera PTMs av samma typ utgör inte någon tvetydighet modifiering platser men är en följd av olika kravet från gemenskapens genomik att visualisera endast enstaka funktioner i taget. PoGo har trots fördelen med mappning post-translationella modifieringar på genomisk koordinater för att möjliggöra studier fokuserar på effekten av genomisk funktioner såsom enda nukleotid varianter på post-translationella modifieringar. Variant mappning använder PoGo, och ökar antalet totala mappningar. Dock belyser unik färgkodning av mappade peptider tillförlitlig mappningar från de opålitliga. Kartläggning av variant peptider identifieras från kända enda nukleotid varianter kan åtföljas av visualisera de mappade peptiderna tillsammans med varianterna i VCF-format. Detta sätt färgkod som anger en opålitlig kartläggning av en variant peptid är överkörda av närvaron av den kända nukleotid-varianten.
Ett avgörande steg för att använda PoGo är användningen av de rätt filer och format. Användningen av översatta avskrift sekvenser som proteinsekvenser bifogas anteckningen i GTF format är de viktigaste kriterierna. En annan kritisk faktor när överväger att använda PoGo mappa peptider med aminosyran missmatchningar är minne. Medan minne högeffektiv för en standardapplikation, leder avsevärt och exponentiellt ökande antalet möjliga mappningar med en eller två avvikelser till en likaså exponentiell ökning av minne användning18. Vi föreslår en stegvis mappning som beskrivs i detta protokoll att först kartlägga peptiderna utan missmatchningar och ta bort dem från uppsättningen. De efterföljande tidigare omappade peptiderna sedan kan mappas med hjälp av en obalans och proceduren kan upprepas med två avvikelser för de peptider som återstående omappade.
Eftersom genomströmning av masspektrometri har ökat betydligt och studier gränssnitt genomisk och proteomiska data blir allt vanligare på senare år, är verktyg för att lätt aktivera gränssnitt dessa typer av data i samma koordinatsystemet allt mer oumbärligt. Verktyget presenteras här kommer stödet de behöver kombinera genomisk och proteomiska data att förbättra förståelsen av integrativ studier över små och stora datamängder genom att mappa peptider på en referens-anteckning. Uppmuntrande nog har PoGo tillämpats för att mappa peptider till genen kandidater i samma format som hänvisningen anteckningen att stödja annotering av romanen gener uttrycks i mänskliga testiklarna35. Den strategi som presenteras här är oberoende av databaser som används för identifiering av peptid. Protokollet kan stöd i identifiering och visualisering av romanen översättning produkter med hjälp av anpassade indata-filer från översättning sekvenser och tillhörande GTF filer från RNA-seq experiment.
Flera metoder och verktyg med ett brett utbud av speciella programscenarier mappa peptider till genomisk koordinater, alltifrån mappning peptider direkt till genomsekvens RNA-sekvensering guidade kartläggning, har varit införda10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. men dessa kan leda till underlåtenhet att korrekt karta peptider när post-translationella modifieringar är närvarande och fel i de underliggande kartläggningen av RNA-sekvensering läser kan spridas till peptid nivån. PoGo har utvecklats specifikt övervinna dessa hinder och att klara den snabba ökningen av kvantitativa högupplösta proteomiska datamängder att integrera med ortogonala genomik plattformar. De verktyg som beskrivs här kan integreras i hög genomströmning arbetsflöden. Genom det grafiska gränssnittet PoGoGUI verktyget är enkel att använda och kräver ingen specialist bioinformatik utbildning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Wellcome Trust (WT098051) och NIH bidraget (U41HG007234) till projektet GENCODE.
PoGo (software) | NA | NA | https://github.com/cschlaffner/PoGo |
PoGoGUI (software) | NA | NA | https://github.com/cschlaffner/PoGoGUI |
TrackHubGenerator (software) | NA | NA | https://github.com/cschlaffner/TrackHubGenerator |
Integrative Genomics Viewer (software) | NA | NA | http://software.broadinstitute.org/software/igv/ |
UCSC genome browser (website) | NA | NA | https://genome.ucsc.edu/ |
GENCODE (website) | NA | NA | http://gencodegenes.org |
Ensembl (website) | NA | NA | http://ensembl.org |
bedToBigBed (software) | NA | NA | http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/ |
fetchChromSizes.sh (software) | NA | NA | http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/ |