Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.
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Artigo de método
Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma fonte promissora de célula para medicina regenerativa e uma plataforma para estudar processos de desenvolvimento humanos. Dirigido por diferenciação que recapitula a processos de desenvolvimento é uma das principais maneiras de gerar células pancreáticas, incluindo a proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionais iniciem a diferenciação com pequenas colônias logo após a passagem. No entanto, no estado de colônias ou agregados, as células são propensas a heterogeneidades, que podem dificultar a diferenciação para PDX1+ células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em PDX1+ células. O protocolo consiste em quatro etapas e inicia a diferenciação por semeadura de células únicas dissociadas. A indução de SOX17+ células da endoderme definitivo foi seguido pela expressão de marcadores de tubo dois instintos primitivos, HNF1β e HNF4α e eventual diferenciação em PDX1+ células. O presente protocolo proporciona fácil manuseio e pode melhorar e estabilizar a eficiência de diferenciação de algumas linhas de hPSC que anteriormente foram encontrados para diferenciar de forma ineficiente em linhagens endodermal ou PDX1+ células.
Introdução
O pâncreas é constituído principalmente por células endócrinas e exócrinas, e sua disfunção ou sobrecarga causa várias doenças, como a pancreatite, diabetes e câncer pancreático. Para elucidar a patogenia da pancreatopathy, é necessário analisar o processo de desenvolvimento e função das células do pâncreas. Além disso, um fornecimento estável de celular com qualidade robusta é necessária para estabelecer a terapia de suplementação de célula/tecido. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma promissora fonte de células para esses fins, e o protocolo de diferenciação para células pancreáticas tem sido intensamente estudado
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Protocolo
Experimentos utilizando hPSCs foram aprovados pelo Comitê de ética do departamento de medicina e pós-graduação faculdade de medicina, Universidade de Kyoto.
1. preparação de materiais
Nota: Prepare todas as mídias e os reagentes para cultura de células em um ambiente estéril. Aquecer a base de meios de cultura à temperatura ambiente (RT) antes do uso. Médio para diferenciação é usada dentro de 6 h em RT. detalhes dos reagentes estão listados na Tabela de materiais.
-
Diferenciação (figura 1A)
- Médio....
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Resultados
HiPSCs propagação (585A129,30) são condensados e formar uma monocamada homogênea (figura 1B) que é adequada para diferenciação. HiPSCs indiferenciados (fase 0) são dissociadas e re-semeados como células únicas, a densidade celular baixa (1-1,5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, as células estão conectadas à placa e começarem a mostrar a protrusão. No dia 1, as células são proliferaram e bem distribuídas para cob.......
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Discussão
A geração de PDX1+ células é composto de várias etapas; Portanto, é fundamental para tratar as células no momento oportuno. Entre as medidas, a eficiência de indução da endoderme definitivo em grande parte, afeta a eficiência de indução final, possivelmente por interferência de outras contaminantes linhagem células (ou seja, mesoderme e ectoderme), que podem proliferar e/ou secretam fatores que interromper a diferenciação específica. Se a proporção de SOX17+ células é inferior a 80% no dia 4 (fase 1.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) através de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) T.T., e subsídio para JSPS bolsistas de pesquisa (número de concessão KAKENHI de JSPS 17J07622) AK, e a agência de Japão para pesquisa médica e desenvolvimento (AMED) através da sua pesquisa conceder "Núcleo centro para pesquisa de células, a rede de centro de pesquisa para realização de medicina regenerativa de iPS" a K.O. Os autores agradecer Dr. Peter Karagiannis por ler o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-Keto-N-aminoetil-N′-aminocaproyldihydrocinamoil cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4- [(E) -2- (5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl] -benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anticorpo anti-CDX2 [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × diluição de 1/1000 |
| B-27 Suplemento (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Suplemento sem soro |
| BD FACSAria II Classificador de Células | BD Biosciences | Para citometria de fluxo | |
| Freezer biomédico | SANYO | MDF-U538 | Para -30 ° C armazenando |
| lâminas de contagem de células para contador de células TC10 / TC20, | vidro de lâmina de contagem | de 1450011 BIO-RAD | |
| PLACA MULTIPOÇOS DE CULTURA DE CÉLULAS, 6 POÇOS, PS, | Greiner BIO-ONE | 657165 | Para cultura de diferenciação/placa de 6 poços |
| Centrífuga | TOMY | AX-310 | Para cultura de células |
| Centrífuga | TOMY | MX-305 | Para RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axônio Medchem | Axônio 1386 | |
| BANCO LIMPO | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Bancada limpa |
| Corning CellBIND Placa de 6 poços | Corning | 3335 | Para cultura sem alimentador de hPSCs/placa de 6 poços |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning | 354230 | Basement membrane matrix | |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | Para cultura sem alimentador de hPSCs/material de superfície sintética para hPSCs |
| Criostato | Leica | Leica CM1510 S | Para imunocoloração de agregados. |
| Kit Cytofix/Cytoperm | Becton Dickinson | 554714 | O tampão Perm/Wash é Tampão de permeabilização/lavagem. O tampão Cytofix/Cytoperm é um tampão de fixação e permeabilização. |
| Caneta Dako | Dako | S2002 | Para imunocoloração de agregados |
| mistura dNTP (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | Para RT-qPCR |
| Anticorpo secundário anti-cabra IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500 |
| Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) Altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500 |
| Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho IgG (H+L) de burro, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Anticorpo secundário, &vezes; diluição de 1/500 |
| Soro de burro | Merck Millipore | S30 | Soro de burro |
| D-PBS(-) sem Ca ou Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Para cultura sem alimentador de hPSCs/hPSC meio de manutenção |
| Falcon 5 mL Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo, com Tampa de Pressão do Filtro | de Células Corning | 352235 Tubo | de poliestireno de fundo redondo de 5 mL com filtro de célula |
| Ponta de filtro, 1.000 µ L | Watoson | 124-1000S | Use junto com pipetas |
| Ponta do Filtro, 20 µ L | Watoson | 124-P20S | Use junto com pipetas |
| Ponta de filtro, 200 µ L | Watoson | 124-P200S | Use em conjunto com pipetas |
| Microscópio de Fluorescência | Keyence | BZ-X700 | Para imunocoloração |
| Incubadora Forma Steri-Cycle CO2 Incubadora | Thermo Fisher Scientific | 370A | |
| HNF-1β Anticorpo (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × diluição de 1/200 |
| HNF-4α Anticorpo (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × diluição de 1/200 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Para coloração de núcleo, × diluição de 1/200 |
| RNA total do pâncreas humano | Ambion | AM7954 | Para RT-qPCR |
| Anticorpo humano PDX-1/IPF1 | R& D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, IgG de cabra, & vezes; 1/200 de diluição |
| de SOX17 humano | Anticorpo R& D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × diluição de 1/200 |
| Meio de opção de zinco MEM melhorado | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Câmara de incubação | Cosmo Bio | 10DO | Para imunocoloração de agregados |
| Luvas de exame de látex | Adachi | ||
| MAS vidro de lâmina revestido | Matsunami Glass | 83-1881 | Para imunocoloração de agregados |
| MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poços | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | para microscópio RT-qPCR |
| Olympus | CKX41N-31PHP | Para cultura celular | |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × diluição de 1/200 |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | Para RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | Para RT-qPCR de sequência é "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldeído, pó | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixador, diluído em DPBS |
| Refrigerador farmacêutico | SANYO | MPR-514 | Para 4 ° C armazenando |
| PIPETMAN P | Pipeta | GILSON | |
| Recombinante Humana KGF/FGF-7 | R& D Systems | 251-KG | KGF |
| Cabeça Humana Recombinante | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinante Humano/Rato/Rato Activin A | R& D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μ L) | TOYOBO | TRT-101 | Para RT-qPCR |
| Conjunto DNase livre de RNase (50) | QIAGEN | 79254 | Para RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | Para RT-qPCR |
| RPMI 1640 com L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Filme de vedação para tempo real | Takara | NJ500 | RT-qPCR |
| 10 mL | Costar/Corning | 4488 | Para cultura de células |
| Pipetas sorológicas 25 mL | Costar/Corning | 4489 | Para cultura de células |
| Pipetas sorológicas 5 mL | Costar/Corning | 4487 | Para cultura de células |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Sinalização celular | 3579S | Anti-SOX2, × diluição de 1/200 |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | Para RT-qPCR | |
| Sucarose | Nacalai tesque | 30406-25 | Para imunocoloração de agregados |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820B | Para RT-qPCR |
| TC20 Contador de Células Automatizado | BIO-RAD | 1450101J1 | Contador de Células |
| Automático Composto OCT Tissue-Tek 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | Para imunocoloração de agregados |
| Tissue-Tek Cryomold Moldes/Adaptadores | Sakura Finetechnical | 4566 | Para imunocoloração de agregados |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Freezer ultrafrio | SANYO | MDF-U33V | Para -80 ° C que armazena |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilua com DPBS para preparar 0,5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | para RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
Referências
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vi....
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Reimpressões e permissões
