Summary

Induction de Syndrome néphrotique chez la souris par Injection rétrooculaire de la doxorubicine et la prévention de la rétention de Volume par LIBERATION PROLONGEE aprotinine

Published: May 06, 2018
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Summary

Nous décrivons ici l’induction de syndrome néphrotique expérimental chez la souris 129S1/SvImJ par injection rapide rétrooculaire de la doxorubicine. Nous traitons également néphrotiques souris avec des boulettes de libération prolongée contenant aprotinine pour inhiber l’activité de la protéase sérine urinaire et prévenir la rétention sodée.

Abstract

Syndrome néphrotique est la manifestation la plus extrême de la maladie rénale protéinurie et caractérisée par la forte protéinurie, hypoalbuminémie et œdème dû à une rétention de sodium et l’hyperlipidémie. Afin d’étudier la physiopathologie de ce syndrome, rongeur modèles ont été développés basée sur l’injection de substances toxiques comme la doxorubicine podocyte endommageant. Chez les souris, seulement quelques souches sont sensibles à ce modèle. Chez les souris de type sauvage de 129S1/SvImJ, l’administration de la doxorubicine par une injection intraveineuse rapide pour le sinus rétrooculaire induit un syndrome néphrotique expérimental qui présente tous les symptômes de la maladie humaine, y compris l’oedème et la rétention de sodium. Après l’apparition d’une protéinurie, pièce souris augmenté activité de protéase de sérine urinaire qui aboutit à l’activation du canal sodique épithélial (ENaC) et rétention sodique. Inhibition pharmacologique des protéases à sérine urinaire par le traitement avec LIBERATION PROLONGEE aprotinine abroge l’activation de l’ENaC et empêche la rétention sodée. Ce modèle est idéal pour étudier la physiopathologie de la proteasuria, i.e., l’excrétion des protéases à sérine active qui provoquent l’activation de l’ENaC de la protéolyse de la sous-unité γ. Cela peut être considéré comme le principal mécanisme d’activation de l’ENaC et rétention sodique dans la maladie de rein albuminuriques.

Introduction

Syndrome néphrotique est caractérisé par l’hyperlipidémie, hypoalbuminémie, œdème et protéinurie lourde et peut être considéré comme la manifestation la plus extrême de la maladie rénale protéinurie. Chez les rongeurs, syndrome néphrotique expérimental peut être induit par une injection unique d’anthracyclines ou puromycine qui entraîne des dommages podocyte et ressemble à la maladie humaine changement minimal et glomérulosclérose segmentaire (FSG)1. Après sa première description en 1955 par Frenk et al. 2, néphrose de nucléosides de puromycine (PAN) chez le rat est devenu un modèle standard pour enquêter sur la pathophysiologie du syndrome néphrotique dans nombreuses études3,4,5,6. Chez la souris, le modèle correspondant peut être induit par les anthracyclines doxorubicine7. Cependant, il y a une forte dépendance-souche génétiquement déterminé par au moins deux loci génétiques8. En outre, il y a des différences dans la réponse de protéinurie et cours du syndrome néphrotique9,10. En utilisant 129S1/SvImJ souris et une injection intraveineuse rapide de la doxorubicine via le sinus rétrooculaire, réponses de protéinurie atteignent des valeurs qui sont suffisants pour induire les caractéristiques typiques du syndrome néphrotique, particulièrement des rétention de volume caractérisée par ascite et presque sans sodium urinaire7. Rétention de sodium dans le syndrome néphrotique expérimental a été présumée être le résultat de l’activation du canal sodium épithélial (ENaC) dans le tubule distal par des protéases de sérine aberrantly filtrée comme la plasmine provoquant la protéolyse de la sous-unité γ4 ,11,12. Récemment, ce concept a été prouvé chez les souris néphrotiques étaient protégés du protéolytique ENaC activation et rétention sodée par traitement avec l’aprotinine d’inhibiteur de protéase sérine qui était tout aussi efficace que l’ENaC bloqueur amiloride13. Afin d’assurer la distribution en continu pour le tubule distal, aprotinine a été administré par l’intermédiaire de granulés à libération prolongée par voie sous-cutanée implantée. Les études à venir sont tenus d’identifier les protéases à sérine qui sont responsables de l’activation protéolytique de ENaC dans le syndrome néphrotique qui semble parallèle à la situation de l’homme. À cette fin, un syndrome néphrotique induite par la doxorubicine est un modèle précieux qui peut être utilisé chez les souris de type sauvage ou élargi à des souris génétiquement modifiées. Ses avantages sont le faible coût du médicament, moins complexe, de gestion et de la bonne reproductibilité14.

Dans cet article, nous démontrons l’induction de syndrome néphrotique expérimental par injection intraveineuse rapide de doxorubicine pour le sinus rétrooculaire et l’implantation de pellets de libération prolongée contenant aprotinine pour inhiber la protéase de sérine urinaire activité mesurée avec un dosage chromogénique.

Protocol

Toutes les méthodes ont été réalisées selon les instituts nationaux de Guide de santé pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire et la législation allemande pour le bien-être des animaux, et elles ont été approuvées par les autorités locales (Regierungspräsidium Tübingen). 1. l’induction de Syndrome néphrotique expérimental par Injection de doxorubicine pour le Sinus rétrooculaire Préparez une seringue 0,5 mL avec une canule de 30G monté en marquant…

Representative Results

Après l’induction de la narcose isoflurane, doxorubicine a été rapidement injectée via le sinus gauche rétrooculaire. La totalité du volume de 7,25 µL/g poids corporel a été injecté sans aucune résistance et prouver l’extravasation corriger emplacement par voie intraveineuse de la canule. La souris récupéré de narcose rapidement et n’avaient aucun réduite ce jour-là et par la suite. En particulier, il n’y avait aucun signe de dommages à l’oeil gauche. Après dox…

Discussion

Ici, nous démontrons que doxorubicine injectable par injection de sinus rétrooculaire induit un syndrome néphrotique expérimental chez la souris 129S1/SvImJ avec protéinurie, rétention sodique, hypoalbumenia et l’hyperlipidémie. Cependant, il y a deux questions cruciales qui doivent être prises en compte lors de l’utilisation de ce modèle. Tout d’abord, la modèle induction est strictement dose-dépendante et déviations de dose doxorubicine aussi petite que 0,3 µg/g affectent la réponse de la souris<sup…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par une subvention de la Fondation de recherche allemande (DFG, AR 1092/2-1).

Materials

supplies
BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany PZN: 07468060 syring
ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) EH7823H suture
Name Company Catalog Number Comments
reagents
aprotinin (6000 KIU/mg) LOXO, Heidelberg, Germany CAS 9087-70-1
Bepanthen, Augen- und Nasensalbe Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany PZN: 1578681 ointment
Chromogenix S-2251 HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany 82 0332 39 chromogenic substrate
doxorubicin (2.0 µg/µL) Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany CAS 25316-40-9 doxorubicin
isofluran CP (1 mL/mL) CP-Pharma, Burgdorf, Germany CAS 26675-46-7 isofluran
pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) Innovative Research of America, Sarasota, FL X-999 pellet
Name Company Catalog Number Comments
equipment
ELx808 Absorbance Mikroplate Reader BioTek, Bad Friedrichshall, Germany ELx808 microplate reader
MICROSTERIL – 436 B.M.S., Trescore Balneario, Italy GAL/436 sterilizer
Hybridization oven/shaker GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK RPN 2511 heat chamber
Thermo MAT Pro 10 W, 15×25 cm, Lucky Reptile Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany 61201 mouse warming device

Referências

  1. Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
  2. Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
  3. Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
  4. Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
  5. Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
  6. Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
  7. Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
  8. Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
  9. Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
  10. Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
  11. Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
  12. Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
  13. Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
  14. Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
  15. Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
  16. Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
  17. Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
  18. Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
  19. Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
  20. Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
  21. Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
  22. Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
  23. Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
  24. Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
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Bohnert, B. N., Artunc, F. Induction of Nephrotic Syndrome in Mice by Retrobulbar Injection of Doxorubicin and Prevention of Volume Retention by Sustained Release Aprotinin. J. Vis. Exp. (135), e57642, doi:10.3791/57642 (2018).

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