Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação
Summary
Nós descrevemos um método novo para a entrega do plasmídeo de DNA em células uroteliais do rato bexiga na vivo através de cateterismo de uretra e eletroporação. Oferece uma maneira rápida e conveniente para gerar modelos de rato autóctone de doenças da bexiga.
Abstract
Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) são extremamente valiosos em revelando romance biológicas insights sobre os mecanismos de iniciação e progressão de doenças como o câncer. Os ratos transgénicos e condicional nocaute foram usados frequentemente para superexpressão do gene ou ablação em tecidos específicos ou célula tipos em vivo. No entanto, gerar modelos de rato germline pode ser demorada e dispendiosa. Recentes avanços no gene edição de tecnologias e a viabilidade de entrega de plasmídeos de DNA por infecção viral permitiram a rápida geração de modelos de câncer não-germline autóctones do mouse para vários órgãos. A bexiga é um órgão que tem sido difícil para vetores virais acessar, devido à presença de uma camada de glicosaminoglicano cobrindo o Urotélio. Aqui, descrevemos um método novo desenvolvido em laboratório para entrega eficiente de plasmídeos de DNA no rato bexiga Urotélio em vivo. Através de instilação intravesical de plasmídeo de DNA pCAG-GFP e eletroporação de bexiga cirurgicamente exposta, nós mostramos que o plasmídeo de DNA pode ser entregues especificamente nas células uroteliais da bexiga para expressão transiente. Nosso método fornece uma maneira rápida e conveniente para superexpressão e nocaute de genes na bexiga do mouse e pode ser aplicado para a construção de GEMMs de câncer de bexiga e outras doenças urológicas.
Introduction
Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) têm jogado um papel essencial em expandir o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento animal, gene funções in vivoe mecanismos de progressão de doença1,2. GEMMs do germline tradicionalmente são desenvolvidos de duas maneiras. A primeira é a criação de ratos transgênicos por injeção pró-nuclear do plasmídeo de DNA seguido a transplantação de zigotos pseudopregnant mulheres. A outra é a geração de batida-para fora/TOC-em ratos por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias e o desenvolvimento de quimeras. Nocaute condicional de genes num tipo específico de tecido ou célula de interesse envolve a criação de alelos geneticamente modificados com Cre e flox sites para várias gerações. Todo o processo pode ser caro e demorado, especialmente se o objetivo é atingir múltiplos genes tecido-especificamente. Recentemente, tecnologias de edição de gene como clusterizadas regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) foram aplicadas aos vários órgãos dos ratos para induzir alterações genéticas de tecido-específica para o cancro autóctone modelagem3, 4,5,6,7 ou doença correta mutações em situ8,9. Nesses estudos, a entrega dos vetores gRNA geralmente foi conseguida através de adenovírus ou particulas de Lentivirus infecção do órgão ou injeção de cauda-veia hidrodinâmica. A relativa facilidade de entrega dos componentes CRISPR para o pulmão e o fígado tem melhorado muito a conveniência e eficiência de câncer nesses órgãos em comparação com os modelos tradicionais de rato Cre-Lox com base de modelagem.
O bexiga Urotélio é onde a maioria dos tumores de bexiga são originários. A entrega dos vetores de DNA para a bexiga Urotélio para terapia de modelagem ou o gene do câncer é dificultada por uma camada de glicosaminoglicano na superfície apical urotelial, que age como uma barreira para a aderência do vírus infeccioso10,11. Vários agentes de pré-tratamento como Syn3 e o dodecil-β-d-maltoside tem sido utilizados para romper essa barreira e melhorar adenovírus infecção eficiência12,13,14. Se o vírus adeno-associado (AAVs) efetivamente podem infectar a bexiga não foi relatado. Em geral, um método de entrega com base não-virais seria desejável. Aqui, descrevemos um método inovador desenvolvido no laboratório para entrega eficiente do plasmídeo de DNA para o Urotélio rato através de cateterismo de uretra e eletroporação. Porque a nossa abordagem não implica pré-tratamento químico da camada glicosaminoglicano ou produção de vírus, significativamente simplifica a entrega de plasmídeos de DNA no rato Urotélio de bexiga e deve facilitar estudos em vivo doenças da bexiga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Electroporation aumenta a permeabilidade da membrana celular e é uma tecnologia poderosa para gene electrotransfer16. Entrega do gene em roedores vivos por eletroporação tem sido frequentemente usada em neurobiologia campos17,18,19,20,21. Suas aplicações potenciais em muitos outros órgãos não tem sido exploradas extensivamente. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Professor Chen Bin, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang para ajuda com a configuração do sistema de eletroporação. Este trabalho foi financiado por doações do grupo de benefício de câncer de Santa Cruz e NIH para Z.A.W.
Materials
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
Referências
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