Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence
Summary
Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.
Abstract
La réparation de bris double-brin (CDB) dans l’ADN est un processus hautement coordonné, ce qui nécessite la formation et la résolution de plusieurs protéines de réparation complexes. Ce processus est réglé par une myriade de protéines qui promouvoir l’association et de dissociation des protéines à ces lésions. Grâce en grande partie à la capacité d’exécuter des écrans fonctionnels d’une vaste bibliothèque de protéines, il y a une plus grande appréciation des gènes nécessaires à la réparation de pause l’ADN double brin. Écrans souvent knock-out ou chimique inhibiteur identifient protéines impliquées dans le processus de réparation à l’aide de toxicité accrue comme marqueur pour une protéine qui est nécessaire pour la réparation de l’ORD. Bien qu’utile pour l’identification de nouvelles protéines cellulaires impliqués dans le maintien de fidélité du génome, analyse fonctionnelle exige la détermination de la question de savoir si la protéine d’intérêt favorise la localisation, formation ou résolution des réparations complexes.
L’accumulation des protéines de réparation peut être facilement détectée comme foyers nucléaires distinctes par microscopie d’immunofluorescence. Ainsi, association et dissociation de ces protéines dans les sites des lésions de l’ADN sont accessibles en observant ces foyers nucléaires à intervalles représentatifs après l’induction de cassures double brin de l’ADN. Cette approche peut également identifier des protéines de réparation mal localisées de facteur, si les défauts de réparation ne se produisent pas simultanément avec des retards incomplètes en réparation. Dans ce scénario, les cassures de l’ADN double brin longue durée peuvent être conçues en exprimant une endonucléase coupe rares (p. ex., I-SceI) dans les cellules où le site de reconnaissance pour l’enzyme ladite a été intégré dans le génome cellulaire. La lésion qui en résulte est particulièrement difficile à résoudre car réparation fidèle réintroduira site de reconnaissance de l’enzyme, ce qui incite une autre série de clivage. Ainsi, les différences dans la cinétique de réparation sont éliminés. Si la réparation complexes ne sont pas formés, localisation a été entravée. Ce protocole décrit la méthodologie nécessaire pour identifier les modifications dans la cinétique de la réparation ainsi que réparation localisation des protéines.
Introduction
Chaque jour, chaque cellule dans le corps humain est bombardé par un estimé 10 000 lésions de l’ADN1. Cette menace existentielle nous met en péril pour les mutations, oncogenèse comme cellule mort. Pour protéger la fidélité du génome, cellules de mammifères ont évolué pour répondre aux lésions de l’ADN avec une série complexe d’associations de protéines et de modifications. Cette réponse est constituée de multiples voies, collectivement connus comme l’ADN des dommages réponse (DDR)2,3. La DDR est constitué de l’accumulation des protéines de réparation de l’ADN à des lésions de l’ADN, coordonnées la fois temporellement et spatialement. DDR induit souvent arrêt du cycle cellulaire afin d’éviter la propagation ou l’intensification des dommages qui peuvent survenir au cours de la réplication d’endommagés ADN2,4,5. À son tour, il est également nécessaire pour assurer la viabilité cellulaire désactiver l’arrêt du cycle cellulaire par la dissociation des complexes de réparation après que réparation est terminée.
Parmi les différents types de dommages à l’ADN, CDB est les plus nocives. Pour réparer la CDB peut entraîner dans les réarrangements chromosomiques ou des destructions à grande échelle tels que la perte des bras chromosomiques ensemble. La réparation des CDB est divisée en deux voies6,7,8. Recombinaison homologue (HR) nécessite une sœur chromosome à utiliser comme une matrice d’ADN et ainsi se limite à fin phases S et G2/M du cycle cellulaire9,10. Fin non homologue rejoindre (NHEJ) n’a pas ces restrictions, mais peut causer des destructions de petites lors de la réparation DSBs11,12.
DSB réparer spécifiquement et la DDR sont en général des zones actives de l’enquête. Malgré organisées en parcours idéalement séparés, il y a beaucoup de redondance. En effet, beaucoup de protéines (BRCA1, BRCA2 et l’APR complexe par exemple) est impliqués dans plusieurs voies13,14,15,16. La réparation d’une lésion par une voie, peut conduire à un intermédiaire de dommages qui doit être réparé par une autre voie14. L’entrelacement de ces voies, combinées à leur tâche complexe de recruter les protéines juste à la bonne place pour le montant précis du temps nécessaire, requiert un processus de réglementation à plusieurs niveaux.
Un récent rapport met en évidence les subtilités de la DDR en démontrant que réparation complexant, résolution et la localisation peuvent chacun séparément être altérée17. L’objectif global du protocole suivant consiste à disséquer définitivement la capacité des cellules pour réparer les ORD. À l’aide de la microscopie en immunofluorescence, accumulation de protéines de réparation sur les sites des dommages peut être visualisée aux points représentatifs de temps après l’induction de la CDB.
Cette technique présente plusieurs avantages aux approches couramment utilisés. Réparation est souvent étudiée à des moments unique et incapable de représenter le processus dynamique de regroupement et de dissociation des complexes de réparation. Observant la totalité de la réparation de l’activation initiale à la pleine résolution assure qu’un retard dans la réparation n’est pas confondu avec une inhibition complète. À l’inverse, il assure que l’induction d’une réponse de réparation qui ne peut inactiver ladite réponse n’est pas confondu avec la normale ou l’activation excessive.
Formation d’un complexe protéique retardée et la mauvaise localisation des protéines de réparation, cependant, ne peuvent pas clairement distinguer grâce à cette approche. Pour déterminer si les protéines de réparation sont mal localisées contre retardés dans leur localisation, une « longue durée » ORD peut être introduit par clivage enzymatique de l’ADN cellulaire. La lésion qui en résulte est retaillée chaque fois qu’il est réparé, ce qui entraîne un accent distinct grande réparation nucléaire et supprimant la restriction temporelle du recrutement. Ceci peut être réalisé en modifiant l’approche existante à l’aide d’une endonucléase coupe rares (p. ex., I-SceI) pour induire une ORD de longue durée. La longévité des CDB permet la visualisation des protéines de réparation insaisissable par la microscopie en immunofluorescence. L’abondance accrue pourrait aussi améliorer la visualisation quand la détection est entravée par la limitation de la qualité de l’anticorps, une caractéristique qui pourrait être utile lorsque le moindre protéines étudiées sont identifiés comme ayant un impact sur la réparation de l’ADN.
En particulier, nous fournissons des instructions explicites pour un logiciel gratuit d’images traitement et analyse (p. ex., ImageJ). Cela supprime un obstacle financier important en analyse d’images, l’interrogatoire de réparation de l’ADN à un public plus large d’ouverture.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse de l’ADN endommagent la réparation en général et la réparation des cassures double brin de l’ADN est précisément un domaine actif de recherche parce que ses conséquences s’étendent de tumorigenèse biologie fondamentale6,20. Détails de ce manuscrit une approche qui dissèque avec précision l’apport de protéines RAD51 et γ-H2AX à la résolution des CDB par HR. hâte, cette méthode peut servir à élucider les fonctions supplément…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Joel Sanneman et Dr Philine Wangemann du noyau microscopie confocale, financé par la Kansas State University College of Veterinary Medicine, pour leur appui des efforts déployés pour développer cette technique. pCBASceI est un cadeau de Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. Les cellules U2OS DR-GFP ont été un gentil cadeau de Maria Jasin18.
Materials
| 12mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
Referências
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