प्रवाह Cytometry के साथ जलीय फिल्म के लक्षण वर्णन
Summary
दृश्य clustering के साथ संयोजन में प्रवाह cytometry एक आसान करने के लिए उपयोग और तेजी से जलीय फिल्म अध्ययन के लिए विधि प्रदान करता है । यह फिल्म लक्षण वर्णन, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में परिवर्तन का पता लगाने के फिल्मी समुदाय संरचना, और अजैव का पता लगाने के कणों में एंबेडेड फिल्म ।
Abstract
consortia सूक्ष्मजीवों के गतिशील है कि मीठे पानी के पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । उनके समुदाय संरचना बदलकर, पर्यावरण परिवर्तन के लिए जल्दी से प्रतिक्रिया और इस तरह पानी की गुणवत्ता के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान में, फिल्म मूल्यांकन ज्यादातर एकीकृत और कार्यात्मक समापन पर आधारित है, जैसे कि संश्लेषक या श्वसन गतिविधि, जो कि फिल्मी समुदाय की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं । फ्लो cytometry और गणनात्मक दृश्य एक वैकल्पिक, संवेदनशील, और समुदाय संरचना के आकलन के लिए आसान करने के लिए उपयोग करने के लिए विधि, विशेष रूप से मीठे पानी के photoautotrophic के भाग की पेशकश । यह केवल मूल नमूना तैयारी की आवश्यकता है, जिसके बाद पूरे नमूने प्रवाह cytometer के माध्यम से चलाया जाता है । एकल सेल ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट जानकारी गणनात्मक दृश्य और जैविक व्याख्या के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके अंय तरीकों पर मुख्य लाभ विश्लेषण की गति और उच्च जानकारी सामग्री प्रकृति हैं । फ्लो cytometry कई सेलुलर और एक ही माप में फिल्म लक्षण के बारे में जानकारी प्रदान करता है: कण आकार, घनत्व, वर्णक सामग्री, अजैव में सामग्री, और मोटे वर्गीकरण जानकारी । हालांकि, यह प्रजातियों के स्तर पर फिल्म रचना पर जानकारी प्रदान नहीं करता है । हम जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के पर्यावरण की निगरानी के लिए विधि के उपयोग में उच्च क्षमता देखते है और एक प्रारंभिक के रूप में फिल्म मूल्यांकन कदम है कि पूरक और अधिक विस्तृत तरीके से विस्तृत जांच बहाव बताते हैं ।
Introduction
जैव फिल्म सूक्ष्म जीवाणुओं की गतिशील consortia है जो मीठे पानी के पारिस्थितिकी प्रणालियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, प्राथमिक उत्पादन से लेकर, पोषक साइकिल चालन, और सूक्ष्मजीवों के वितरण को प्रभावित करने के लिए जल शोधन और पारिस्थितिकी तंत्र में उनकी जैव विविधता 1. जब इस तरह के रसायनों के रूप में पर्यावरण की स्थिति या तनाव को बदलने के लिए उजागर कर रहे हैं, उनके समुदाय संरचना जल्दी से अधिक सहिष्णु प्रजातियों में बदलाव2,3. उनके उच्च संवेदनशीलता पर्यावरण निगरानी4के लिए आकर्षक मॉडल सिस्टम में बदल जाता है, लेकिन मौजूदा तरीकों में से कोई भी पूरी तरह से वास्तव में एक तेज और आसान तरीका में एक फिल्म समुदाय के गतिशील का पता लगाने के लिए अनुकूल है ।
आम तौर पर इस्तेमाल किया तरीकों का सेट करने के लिए, फिल्म विशेषताएं कार्यात्मक और संरचनात्मक समापन की माप के होते हैं । पूरे समुदाय के स्तर पर, संश्लेषक और श्वसन गतिविधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से extracellular एंजाइमों की गतिविधि के कार्यात्मक राज्य के बारे में जानकारी प्रदान करता है5,6,7,8 ,9. बायोमास प्रारम् भ किया जाता है जो समग्र रूप से फिल्म विकास के लिए एक संकेतक है । संरचनात्मक परिवर्तन वर्तमान में या तो प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ या न्यूक्लियोटाइड आधारित तकनीक के साथ पारंपरिक प्रजातियों की पहचान का उपयोग करके मापा जाता है (उदा., denaturing ढाल जेल ट्रो (DGGE), स्वचालित राइबोसोमल intergenic स्पेसर विश्लेषण (ARISA), metagenomics)10,11,12. इन तरीकों की जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन समय लेने वाले हैं, या विशिष्ट ज्ञान की आवश्यकता है, या विकास के तहत अभी भी कर रहे हैं । अंत में, extracellular पॉलिमर पदार्थों के मूल्यांकन के लिए नए तरीकों (ईपीएस)13,14 और इस फिल्म वास्तुकला1, जबकि संवेदनशील, कम प्रवाह कर रहे हैं और अभी तक की दिशा में विकसित नहीं किया गया है निगरानी प्रयोजनों ।
यह स्पष्ट है कि मीठे पानी के लिए एक पूर्ण विशेषताओं के लिए, यह आवश्यक है के लिए कई विभिंन तरीकों, गठबंधन है, जो फिल्म समारोह, संरचना और वास्तुकला में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । पर्यावरण की निगरानी के लिए, दूसरी ओर, एक तेजी से और संवेदनशील तरीका है कि जैव फिल्म में परिवर्तन का पता लगाने और कार्यात्मक और संरचनात्मक स्तर पर बदलाव की बुनियादी जैविक व्याख्या सक्षम है की आवश्यकता है ।
हम धारा के phototrophic घटक के माइक्रोबियल समुदाय लक्षण वर्णन के लिए एक नई विधि विकसित की है फिल्म (periphyton), जो काफी तेजी से निगरानी के प्रयोजनों के लिए है, और एक ही समय में जैविक फिल्म समुदाय पर पर्याप्त जानकारी प्रदान करता है संरचना जैविक व्याख्या15की अनुमति के लिए । यह एकल सेल फ्लो cytometry (एफसी) पर आधारित है फिल्म के नमूनों की और अभिकलनी दृश्य के साथ युग्मित और एकल कोशिका स्तर पर फिल्म के ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट संपत्तियों पर जानकारी प्रदान करता है ।
इस कार्यप्रवाह के बाद फिल्म नमूना sonication के रूप में नमूना तैयारी के होते हैं, निर्धारण और आकार-आधारित छानने के नमूनों के प्रवाह cytometry द्वारा नमूने का आकलन द्वारा पीछा किया । प्राप्त डेटा एक ही माप में कई सेलुलर लक्षण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं: कण आकार, घनत्व, वर्णक सामग्री, अजैव सामग्री (जैसे microplastics) में फिल्म । डेटा का यह सेट गणना दृश्य stochastic पड़ोसी embedding (वइसने)16, जो डेटा की तेजी से और आसान व्याख्या सक्षम बनाता है का उपयोग कर के माध्यम से विश्लेषण किया है । हालांकि कुछ हफ्तों के लिए स्थापित करने और विधि का अनुकूलन, एक बार की स्थापना की आवश्यकता है, यह केवल कुछ ही घंटे के परिणाम की व्याख्या करने के लिए इस फिल्म के नमूने इकट्ठा करने से लेता है ।
दूसरों पर प्रस्तुत विधि का मुख्य लाभ विश्लेषण और उच्च जानकारी सामग्री की गति कर रहे हैं । इसके अलावा, नमूने उनके ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति संपत्तियों की हानि के बिना संग्रह के बाद कई हफ्तों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । यह बहुत उपयोगी हो सकता है जब नमूनों की एक बड़ी संख्या का लक्षण वर्णन, जैसे बड़े नमूने अध्ययन या कार्यक्रमों की निगरानी के रूप में आवश्यक है, लेकिन यह भी छोटे खोजपूर्ण अध्ययन में जानकारी का एक पर्याप्त राशि प्रदान कर सकते हैं ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक धारा के विभिंन स्थानों से एकत्र phototrophic (periphyton) के प्रवाह-cytometric विश्लेषण पर आधारित है । प्रोटोकॉल के कई कदम, प्रयोजनों की निगरानी के लिए उपयुक्त साइटों के चयन उदा , अनुसंधान के लक्ष्यों पर निर्भर करता है और इसलिए निर्धारित नहीं किया जा सकता है । दूसरों को कम स्वतंत्रता की अनुमति है और आवश्यकता है कि प्रोटोकॉल बारीकी से पीछा किया जाता है, यह नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल में स्पष्ट कर दिया है ।
प्रोटोकॉल के साथ शुरू होता है के लिए साइटों के चयन के लिए फिल्म आधारित पर्यावरण की निगरानी । अगले कदम के लिए सेट अप प्रवाह है-cytometer (एफसी) इतना है कि इसके मापन के लिए निगरानी वातावरण में फिल्म में रहने वाले विभिंन phototrophic जीवों के बीच भेदभाव सक्षम है । यह साइटों से फिल्म के नमूनों का संग्रह द्वारा किया जाता है, विभिंन प्रजातियों में मौजूद फ्लोरोसेंट गुणों की पहचान करने के लिए और लेजर और फिल्टर है कि उपयुक्त ऑप्टिकल पर माप सक्षम के साथ प्रवाह-cytometer की स्थापना । तरंगदैर्य. एक बार जब एफसी की स्थापना की गई है, एक समय में फिल्म साइटों से एकत्र किया जा सकता है, ऑप्टिकल और फ्लोरोसेंट गुणों के प्रवाह-cytometry द्वारा मापा में मौजूद एकल कणों के, और डेटा दृश्य clustering द्वारा विश्लेषण । परिणामों की बेहतर व्याख्या के लिए, यह स्थानीय के एक एफसी संदर्भ डेटाबेस का निर्माण करने के लिए संभव है फिल्म प्रजाति के रहने वाले और उनके phenotypes और डेटाबेस का उपयोग करने के लिए एफसी डेटा में विभिंन वर्गीकरण की पहचान । सत्यापन के माध्यम से संभव है प्रतिदीप्ति-आधारित एकल कोशिकाओं की पहचान की छंटाई समूहों का उपयोग FACS और सूक्ष्म आधारित वर्गीकरण पहचान वर्तमान प्रजातियों में से एक है । प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1में दिया जाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित अपेक्षाकृत को लागू करने के लिए आसान है । हालांकि, जबकि प्रस्तुत डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स सभी phototrophic के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया है इस प्रकार अब तक परीक्षण, अनुकूलन (जैसा कि प्रोटोकॉल मे?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्रस्तुत कार्य को एक SNF Ambizione फेलोशिप (PZ00P2_142533) और एक Velux रिसर्च ग्रांट (Amplebig) ने समर्थन दिया था । हम प्रयोगात्मक कार्य के साथ मदद के लिए Bettina Wagner शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
Referências
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