Karakterisering av vattenlevande biofilmer med flödescytometri
Summary
Flödescytometri i kombination med visuella kluster erbjuder en lätt-till-använda och snabb metod för att studera vattenlevande biofilmer. Det kan användas för biofilm karaktärisering, identifiering av förändringar i biofilm gemenskapens struktur, och upptäckt av abiotiska partiklar inbäddad i biofilmen.
Abstract
Biofilmer är dynamiska konsortier av mikroorganism som spelar en nyckelroll i sötvatten ekosystem. Genom att ändra deras samhällsstruktur, biofilmer svara snabbt på miljöförändringar och därmed kan användas som indikatorer på vattenkvalitet. För närvarande är biofilm bedömning mestadels baserade på integrativ och funktionella slutpunkter, såsom fotosyntetiska eller respiratorisk verksamhet, som inte ger information om biofilm gemenskapsstrukturen. Flödescytometri och computational visualisering erbjuder en alternativ, känslig och lätt-till-använda metod för bedömning av gemenskapens sammansättning, särskilt den photoautotrophic delen av sötvatten biofilmer. Det kräver endast grundläggande provberedning, varefter hela provet körs genom flödescytometer. Information om encelliga optiska och fluorescerande används för computational visualisering och biologiska tolkningen. Dess främsta fördelar över andra metoder är hastigheten på analys och hög-information-innehåll karaktär. Flödescytometri ger information om flera mobilnät och biofilm drag i en enskild mätning: partikelstorlek, densitet, pigment innehåll, abiotiska innehåll i biofilm och grova taxonomisk information. Men ger den inte information om biofilm sammansättning på artnivå. Vi ser stor potential i att utnyttja metoden för miljöövervakning av akvatiska ekosystem och som en första biofilm utvärdering steg som informerar nedströms detaljerade undersökningar av kompletterande och mer detaljerade metoder.
Introduction
Biofilmer är dynamiska konsortier av mikroorganism som spelar en nyckelroll i sötvatten ekosystem, alltifrån primärproduktion, näringsämne cykling och vattenrening till att påverka fördelningen av mikroorganismer och deras biologiska mångfald i ekosystemet 1. När biofilmer utsätts till växlande miljöförhållanden eller stressfaktorer, såsom kemikalier, deras gemenskapsstruktur snabbt skiftar mot mer toleranta arter2,3. Deras hög känslighet förvandlar biofilmer till attraktiva modellsystem för miljömässiga övervakning4, dock ingen av de nuvarande metoderna passar perfekt att faktiskt spåra dynamiken i en biofilm gemenskap på ett snabbt och enkelt sätt.
Vanliga består metoder för att karakterisera biofilmer av mätning av funktionella och strukturella slutpunkter. På nivån för hela gemenskapen ger fotosyntetiserande och respiratoriska aktivitet samt aktiviteten av extracellulära enzymer information om funktionella biofilm5,6,7,8 ,9. Biomassa periodisering används som en indikator för övergripande biofilm tillväxt. Strukturella förändringar mäts för närvarande antingen genom att använda traditionella artbestämning med ljusmikroskop eller med nukleotidbaserade tekniker (t.ex., denaturing gradient gel-elektrofores (DGGE), automatiserade ribosomal intergenic spacer analys (ARISA), metagenomik)10,11,12. Dessa metoder ger information men är tidskrävande att utföra eller kräver specifika kunskaper, eller är fortfarande under utveckling. Slutligen, nya metoder för utvärdering av den extracellulära polymera substanser (EPS)13,14 och biofilm arkitektur1, medan känslig, låg genomströmning och har ännu inte utvecklats mot övervakningsändamål.
Det är uppenbart att för en fullständig karakterisering av sötvatten biofilmer, är det nödvändigt att kombinera flera olika metoder, som ger inblick biofilm funktion, sammansättning och arkitektur. För miljöövervakning, däremot, krävs en snabb och känslig metod som kan upptäcka förändringar i biofilmen och aktivera grundläggande biologiska tolkningen av förskjutningarna på funktionella och strukturella nivå.
Vi har utvecklat en ny metod för mikrobiell gemenskapen karakterisering av den phototrophic delen av stream biofilmer (vegetarianer), vilket är tillräckligt snabbt för övervakningsändamål och samtidigt ger tillräcklig information om gemenskapens biofilm struktur att tillåta biologiska tolkningen15. Det är baserat på encelliga flödescytometri (FC) biofilm prover och tillsammans med computational visualisering och ger information om optiska och fluorescerande egenskaper av biofilmen på enstaka cellnivå.
Arbetsflödet efter biofilm provtagningen består av provberedning i form av ultraljudsbehandling, fixering och storlek-baserade filtrering av proverna följt av bedömningen av provet av flödescytometri. Förvärvade data ger information om flera olika cellulära egenskaper i en enda mätning: partikelstorlek, densitet, pigment innehåll, abiotiska innehåll (t.ex. mikroplast) i biofilmen. Denna uppsättning data är än analyseras via computational visualisering med hjälp av visuella stokastiska granne inbäddning (viSNE)16, som möjliggör snabb och enkel tolkning av data. Även om ett par veckor krävs för att ställa in och optimera metoden, en gång ställa, det tar bara några timmar från att samla in proverna som biofilm att tolka resultaten.
De främsta fördelarna med den presenterade metoden framför andra är hastigheten på analys och hög-information-innehåll. Proverna kan dessutom lagras i flera veckor efter samlingen utan förlust av deras optiska och fluorescens egenskaper. Detta kan vara mycket användbart när karakterisering av ett stort antal prover krävs, till exempel stora provtagning studier eller biologisk övervakning program, men kan också ge en betydande mängd information i mindre undersökande studier.
Presenterade protokollet är baserat på flöde-flödescytometrisk analys av phototrophic biofilmer (vegetarianer) som samlats in från olika platser i en ström. Många steg i protokollet, t.ex. valet av platser lämpliga för övervakningsändamål beror på målen för forskningen och därför inte kan förskrivas. Andra ger mindre frihet och kräva att protokollet följs noggrant, detta görs klart i det detaljerade protokollet nedan.
Protokollet börjar med valet av platser för biofilm-baserade miljöövervakning. Nästa steg är att ställa upp den-flödescytometer (FC) så att dess mätningar möjliggör diskriminering mellan olika phototrophic organismer som lever i biofilmer i övervakad miljö. Detta görs genom att samla biofilm prover från webbplatser, att identifiera de fluorescerande egenskaperna hos olika arter förekommer i biofilmen och ställa in flödescytometer med lasrar och filter som gör att mätning vid lämplig optisk våglängder. När FC har set-up, biofilmer kan samlas in från webbplatser regelbundet, optiska och fluorescerande egenskaperna för de enda partiklarna i den biofilm som mätt med flödescytometri, och data analyseras av visuella klustring. För bättre tolkning av resultaten är det möjligt att bygga en FC referensdatabas av lokala biofilm-levande arter och deras fenotyper och använda databasen för att identifiera olika taxonomier i FC data. Validering är möjligt genom fluorescens-baserade sortering av identifierade kluster av enstaka celler använder FACS och mikroskopi-baserade taxonomisk identifiering av den aktuella arten. En schematisk av protokollet ges i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs ovan är relativt enkel att genomföra. Samtidigt presenterade standardinställningarna har visat sig vara lämplig för alla phototrophic biofilm testat hittills, är dock optimering (som beskrivs i protokollet) nödvändigt att maximera den information som erhålls från metoden. Faktiskt kan den optiska och fluorescerande egenskaper för biofilmer variera beroende på miljöförhållanden (säsong, temperatur, kemiska sammansättningen av vattnet)1. Det är därför viktigt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Presenterade arbetet stöddes av en SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) och ett Velux forskningsanslag (Amplebig). Vi skulle vilja tacka Bettina Wagner för hjälp med det experimentellt arbetet.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
Referências
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton – comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. . Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry – Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
