Karakterisering af akvatiske biofilm med flowcytometri

Summary

Flowcytometri i kombination med visual klynger tilbyder en nem at bruge og hurtig metode til at studere akvatiske biofilm. Det kan bruges til biofilm karakterisering, registrering af ændringer i biofilm Fællesskabets struktur og påvisning af abiotiske partikler indlejret i biofilm.

Abstract

Biofilm er dynamisk konsortier af mikroorganisme, som spiller en nøglerolle i ferskvand økosystemer. Ved at ændre deres Fællesskabets struktur, biofilm reagere hurtigt på miljøforandringer og kan således bruges som indikatorer for vandkvaliteten. I øjeblikket er biofilm vurdering for det meste baseret på integrativ og funktionelle endepunkter, såsom fotosyntetiske eller respiratorisk aktivitet, som ikke giver oplysninger om biofilm Fællesskabets struktur. Flowcytometri og beregningsmæssige visualisering tilbyde en alternativ, følsomme og nem at bruge metode til vurdering af Fællesskabets sammensætning, især den photoautotrophic del af ferskvand biofilm. Det kræver kun grundlæggende prøveforberedelse, hvorefter hele prøven køres gennem flow Flowcytometret. Enkelt celle optiske og fluorescerende oplysninger bruges til beregningsmæssige visualisering og biologiske fortolkning. Dets vigtigste fordele frem for andre metoder er hastigheden af analyse og høj-informationsindhold karakter. Flowcytometri indeholder oplysninger om flere cellulære og biofilm træk i en enkelt måling: partikelstørrelse, tæthed, pigment indhold, abiotiske indhold i biofilm og grove taksonomiske oplysninger. Det indeholder dog ikke oplysninger om biofilm sammensætning på artsniveau. Vi ser stort potentiale i anvendelsen af metoden til miljøovervågning af vandøkosystemer og som en indledende biofilm evaluering skridt, der informerer nedstrøms detaljerede undersøgelser af komplementær og mere detaljerede metoder.

Introduction

Biofilm er dynamisk konsortier af mikroorganisme, som spiller en nøglerolle i ferskvand økosystemer, lige fra primærproduktion, næringsstof cykling og vandrensning til at påvirke fordelingen af mikroorganismer og deres biodiversitet i økosystemet ¹. Når biofilm er udsat for skiftende miljøforhold eller til stressfaktorer, såsom kemikalier, deres fællesskabsstruktur hurtigt skifter retning mere tolerante arter^2,3. Deres høje følsomhed forvandler biofilm til attraktive modelsystemer for miljømæssige overvågning⁴, men ingen af de nuværende metoder er perfekt egnet til faktisk spore dynamikken i en biofilm Fællesskabet i en hurtig og nem måde.

De almindeligt anvendte sæt af metoder til at karakterisere biofilm består af måling af funktionelle og strukturelle slutpunkter. På niveauet for hele Fællesskabet indeholder fotosyntetiske og respiratoriske aktivitet samt aktiviteten af ekstracellulære enzymer oplysninger om funktionelle status af biofilm^{5,6,7,8 ,9}. Biomasse periodisering bruges som en indikator for samlede biofilm vækst. Strukturændringer måles i øjeblikket enten ved hjælp af traditionelle arter identifikation med lysmikroskopi eller med nukleotid-baserede teknikker (f.eks., denaturering gradient gelelektroforese (DGGE), automatiseret ribosomale intergenic spacer analyse (ARISA), metagenomics)^10,11,12. Disse metoder give oplysninger, men er tidskrævende at udføre, eller kræver specifik viden, eller er stadig under udvikling. Endelig, nye metoder til evaluering af ekstracellulære polymere stoffer (EPS)^13,14 og biofilm arkitektur¹, mens følsomme, er lav-overførselshastighed og endnu ikke er blevet udviklet til overvågningsformål.

Det er indlysende, at for en fuldstændig karakterisering af ferskvand biofilm, er det nødvendigt at kombinere flere forskellige metoder, som giver indsigt i biofilm funktion, sammensætningen og arkitektur. For miljøovervågning, på den anden side er en hurtig og følsom metode, der er i stand til at opdage ændringer i biofilm og aktiverer grundlæggende biologiske fortolkning af forskydninger på funktionelle og strukturelle plan påkrævet.

Vi har udviklet en ny metode for mikrobielle samfund karakterisering af komponenten fototopiske, stream biofilm (periphyton), som er hurtig nok til overvågningsformål, og samtidig giver tilstrækkelige oplysninger om Fællesskabets biofilm struktur til at tillade biologiske fortolkning¹⁵. Det er baseret på én celle flowcytometri (FC) af biofilm prøver og kombineret med computational visualisering og giver oplysninger om optisk og fluorescerende egenskaber af biofilm på enkelt celle-niveau.

Arbejdsgang efter biofilm prøveudtagningen består af prøveforberedelse i form af sonikering, fiksering og størrelse-baseret filtrering af prøverne efterfulgt vurdere prøven ved flowcytometri. De indsamlede data indeholder oplysninger om flere cellulære træk i en enkelt måling: partikelstørrelse, tæthed, pigment indhold, abiotiske indhold (f.eks. microplastics) i biofilm. Dette sæt af data er analyseret via beregningsmæssige visualisering ved hjælp af visuelle stokastiske nabo embedding (viSNE)¹⁶, som giver mulighed for hurtig og nem fortolkning af data. Selv om et par uger er forpligtet til at konfigurere og optimere metoden, en gang sat op, det tager kun et par timer fra indsamling af biofilm prøver at fortolke resultaterne.

De vigtigste fordele ved metoden præsenteres over andre er hastigheden af analyse og høj-oplysninger-indhold. Derudover kan prøver opbevares i flere uger efter samling uden tab af deres optisk og fluorescens egenskaber. Dette kan være meget nyttigt, når karakterisering af et stort antal prøver er nødvendige, såsom store stikprøver undersøgelser eller bioovervågning programmer, men kan også give en betydelig mængde af oplysninger i mindre sonderende undersøgelser.

Den præsenteres protokol er baseret på flow-cytometric analyse af fototopiske biofilm (periphyton) indsamlet fra forskellige steder i en stream. Mange trin i protokollen, f.eks. udvælgelsen af lokaliteter passende til overvågningsformål, afhænger af mål for forskningen og derfor ikke kan ordineres. Andre tillade mindre frihed og kræve, at protokollen er fulgt nøje, dette er gjort klart i den detaljerede protokollen nedenfor.

Protokollen starter med udvalg af steder for biofilm-baserede miljøovervågning. Det næste skridt er at set-up flow-Flowcytometret (FC), så dens målinger aktiverer forskelsbehandling mellem forskellige fototopiske organismer, der lever i biofilm i den overvågede miljø. Dette udføres ved at indsamle biofilm prøver fra websteder, identificerer de fluorescerende egenskaber af forskellige arter, der forekommer i biofilm og opsætning af flow-Flowcytometret med lasere og filtre, der aktiverer måling på den passende optiske bølgelængder. Når FC er blevet set-up, biofilm kan blive indsamlet fra websteder med jævne mellemrum, optisk og fluorescerende egenskaberne for én partikler findes i biofilm målt ved flowcytometri og dataene analyseres af visual klynger. For en bedre fortolkning af resultaterne er det muligt at bygge en FC referencedatabase af lokale biofilm-levende arter og deres fænotyper og bruge databasen til at identificere forskellige taksonomier i FC data. Validering er muligt gennem fluorescens-baseret sortering af de identificerede klynger af enkelt celler ved hjælp af FACS og mikroskopi-baserede taksonomisk identifikation af de foreliggende arter. En skematisk af protokollen er angivet i figur 1.

Protocol

1. økosystem udvælgelse og Biofilm prøveudtagning Vælg en akvatiske økosystem af interesse og finde prøveudtagning sites hvor biofilm vokse. Lavvandede dele af en stream med langsom til medium vandflow og en stenede streambed for biofilm vedhæftet fil er passende17,18. Valgfrit: Hvis webstedet ikke har nok overflader for biofilm vedhæftet fil, eller at mindske biofilm variationen inden for et websted, placere kunstige substrater for bi…

Representative Results

Ved hjælp af den procedure, der er præsenteret her (figur 1), blev prøver fra flere steder i en lokal stream i Schweiz analyseret. På hvert sted, tre lignende mellemstore sten (10-12 cm) er taget, og biofilm var børstet ud stenene. Prøverne blev derefter sonicated, faste, filtreret og senere analyseret ved flowcytometri. Opsætningen af flow forskellige og referencedatabase bruges var de samme som beskrevet i en tidligere papir15…

Discussion

Den protokol, der er beskrevet ovenfor er relativt enkle at gennemføre. Men mens præsenteres standardindstillingerne har vist sig at være egnet til alle fototopiske biofilm testet hidtil, optimering (som beskrevet i protokollen) er nødvendigt at maksimere oplysningerne fra metoden. Faktisk, den optiske og fluorescerende egenskaber af biofilm kan variere, afhængigt af miljøforhold (sæson, temperatur, vandets kemiske sammensætning)¹. Derfor er det vigtigt at tage hensyn til denne variabilite…

Materials

Multimeter	WTW	MultiLine 3620 IDS	For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner	VWR International	97043-986	Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios	Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Plate reader	Tecan	Infinite M200	used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter	Beckman Coulter	MoFlo Astrios	Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 135	Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab	MathWorks	R2013a	software for numerical computing
CYT	Dana Pe'er Lab	Version 1.1	free interactive visualization tool for analysis of cytometry data