Um método de preparação de amostra eficiente para melhorar os sinais de íon carboidrato em espectrometria de massa de ionização/dessorção de Matrix-assisted Laser
Summary
Um protocolo para melhorar os sinais de íon de carboidrato em espectrometria de massa MALDI por reformas estruturas cristalinas durante os processos de preparação de amostra é demonstrado.
Abstract
Preparação da amostra é um processo crítico na análise de espectrometria de massa (MS) de hidratos de carbono. Apesar de dessorção/ionização de laser assistida por matriz (MALDI) MS é o método de escolha na análise de hidrato de carbono, reprodutibilidade de dados e sinal pobre do íon de amostras de hidrato de carbono continuam a ser problemas graves. Para análise quantitativa de hidratos de carbono, um protocolo eficaz analítico, oferecendo qualidade superior dos dados é necessário. Este vídeo demonstra os protocolos de preparação de amostra para melhorar a intensidade do sinal e minimizar a variação de dados de carboidratos em MALDI-MS. Após a secagem e cristalização de gotas da amostra, a morfologia do cristal é reformada por metanol antes da análise de espectrometria de massa. A melhoria no sinal de hidrato de carbono é examinada com espectrometria de massa MALDI imagem (IMS). Resultados experimentais mostram que a reforma de cristal ajusta estruturas cristalinas e redistribui os analitos de hidrato de carbono. Em comparação com o método de preparação de gotas secas em convencional MALDI-MS, reforma morfologias de cristal de hidrato de carbono com metanol mostra significativamente melhor intensidade de sinal, distribuição de imagem de íon e estabilidade de dados. Desde os protocolos demonstrados neste documento não implicam mudanças na composição da amostra, eles são geralmente aplicáveis aos vários hidratos de carbono e matrizes.
Introduction
Análise de carboidratos é um assunto importante e desafiador. Carboidratos e seus derivados desempenham importantes funções no vivendo organismos1,2,3. Estas moléculas têm complicado estruturas e são propensas a se decompor. Muitos deles não podem ser claramente caracterizados devido às dificuldades de separação e deteção. Apesar do laser assistida por matriz (MALDI) de dessorção/ionização espectrometria (MS) foi aplicada a análise de uma ampla gama de biomoléculas, devido à sua sensibilidade e resultados compreensíveis4, analisar carboidratos usando MALDI-MS continua para ser um grande desafio devido a eficiência de ionização baixa de tais moléculas5. Derivatização química é uma maneira comum para melhorar a eficiência de ionização de hidratos de carbono6,7, mas tais procedimentos são tempo e consumo de amostra. Além disso, a eficiência de ionização pyrazole hidratos de carbono é ainda menor do que de proteínas. Assim, o desenvolvimento de métodos para melhorar o sinal do hidrato de carbono em MALDI-MS sem procedimentos complicados é necessário.
A aplicação de MALDI-MS para análise quantitativa é um outro assunto desafiador. Um grande problema de MALDI-MS é que sua sensibilidade e dados reprodutibilidade depende criticamente protocolos de preparação de amostra e parâmetros experimentais. Em muitos casos, a análise quantitativa por MALDI-MS é confiável devido morfologias amostra heterogênea e distribuição do analito. Um exemplo bem conhecido é amostras preparadas com uma matriz MALDI (DHB) ácido benzoico-2,5. Quando DHB se cristaliza lentamente sob ambiente ambiental, a extensão da incorporação do analito em cristais de matriz é imprevisível, porque resultantes amostras mostram morfologias irregulares. Tais amostras são geralmente compostos por cristais em forma de agulha e bem grandes. Quando DHB é preparado usando um solvente volátil e/ou uma placa da amostra aquecida, um processo de secagem rápido resulta em cristais bem mais homogêneas e melhor resultados quantitativos8,9,10. Essa técnica é conhecida como “recristalização” de amostras MALDI. A melhoria é atribuída a melhor incorporação de analitos cristais matriz bem durante o processo de rápida cristalização. Também demonstrámos que ajustar o ambiente de preparação de amostra reduzida a heterogeneidade de sinal de hidrato de carbono e melhoria de resultados quantitativos11,12. Os achados nestas obras sugerem que a morfologia da amostra é um fator crítico na determinação de qualidade de sinal do hidrato de carbono. Para desenvolver uma estratégia geral para análise diária, um método de reforma de amostra eficiente proporcionando sensibilidade melhorada de carboidratos é necessário.
Examinámos, sistematicamente, a correlação entre sensibilidade de morfologia e hidrato de carbono de amostra em MALDI-MS em um recente relatório13. Os resultados obtidos usando vários carboidratos importantes e matrizes de mostrar que o melhor acessório de sinal é cumprido por recristalização secas amostras MALDI. A morfologia das amostras preparadas usando o método convencional da gota secos (DD) é reformada por recristalização rápida com metanol (MeOH). Os protocolos de preparação de amostra detalhada são demonstrados aqui. O protocolo consiste em três etapas principais, incluindo amostra placa pré-condicionamento, deposição de amostra e recristalização e análise de espectrometria de massa. Os carboidratos utilizados incluem sialyl-lewis (SLeA) e maltoheptaose (MH). DHB é usado como uma matriz de modelo. Os resultados mostram que intensidade de sinal do hidrato de carbono e distribuição espacial aumentou consideravelmente após a recristalização. Esse método pode ser aplicado para amostras com outras matrizes populares, incluindo 2.4.6-trihydroxyacetophenone (THAP) e α– cyano-4-hidroxicinâmicos ácido. Este método serve como uma abordagem geral que pode ser facilmente integrada na rotina do laboratório para análise de carboidratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterogeneidade da amostra é que um problema crucial no DD MALDI-MS. é o mais usado método de preparação de amostra, mas os cristais resultantes são altamente heterogêneos. Tais exemplos mostram reprodutibilidade pobre sinal de tiro-ao-shot e amostra-para-amostra. Portanto, procurando por “sweet spots” em áreas de amostra durante a aquisição de dados é um procedimento comum em experimentos MALDI. Tais amostras heterogêneas são impróprias para quantificação em análises de rotina.
<p class="jove_conten…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores têm sem agradecimentos.
Materials
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
Referências
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