Hier presenteren we een protocol voor de fabricage van kleurovergang nanopattern platen via thermische nanoimprinting en de methode van het screenen van reacties van menselijke endotheliale voorlopercellen op de nanostructuren. Met behulp van de beschreven technologie, is het mogelijk om te produceren van een steiger die fysieke stimuli cel gedrag kunt bewerken.
Nanotopography kan worden gevonden in verschillende extracellulaire matrices (ECMs) rond het lichaam en is bekend dat belangrijke regelgevende acties op cellulaire reacties. Het is echter moeilijk om te bepalen van de relatie tussen de grootte van een nanostructuur en de reacties van de cellen als gevolg van het gebrek aan goede screening tools. Hier, laten we de ontwikkeling van reproduceerbaar zijn en kosteneffectieve verlopende nanopattern platen voor het manipuleren van cellulaire reacties. Met behulp van anodic aluminium oxide (AAO) als een meester mal, verlopende nanopattern platen met nanopillars van toenemende diameter bereiken [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) en 280-360 nm (GP 280/360)] werden vervaardigd door een thermisch inprenting techniek. Deze verlopende nanopattern platen werden ontworpen om na te bootsen de verschillende maten van nanotopography in de ECM en werden gebruikt om het scherm van de antwoorden van menselijke endothelial kolonie-vormende cellen (hECFCs). In dit protocol beschrijven we de stapsgewijze procedure voor het fabriceren van de gradiënt nanopattern platen voor cel engineering, technieken voor het cultiveren van hECFCs uit menselijk perifere bloed en kweken van hECFCs op nanopattern platen.
Onlangs, heeft de reactie van cellen door de fysieke stimulatie van oppervlakte topografie schijnwerpers geweest op het gebied van cel engineering1,2,3,4. Daarom geweest meer aandacht gericht op driedimensionale nanostructuren op de oppervlakte van cel bijlage5. Er werd gemeld dat het integrine, oftewel het oppervlak erkenning apparaat van de cel, de fysieke prikkel gedreven door de structuren van de micro-nano voor ECM t/m mechano-transductie6 verzendt. Deze mechanische stimulatie cel gedrag via contact begeleiding7 reguleert en induceert cytoskeletal reorganisatie om vorm, naast focal verklevingen en stijfheid van cellen8te veranderen.
Menselijke endotheliale voorlopercellen (hEPCs) in het lichaam werken nauw met de communicatie van de omliggende ECM-9. Dit geeft aan dat de fysische toestand van de ECM als een belangrijke parameter voor specifieke cel-matrix hechting complexvorming fungeert zoveel schuifspanning afgeleid van bloed stroom10. Het is gemeld dat de oppervlakte nanotopography de in vitro -vorming van uitgebreide capillair netwerken van hEPCs11 verbetert en dat een ECM/bio-oplosbare factor gecombineerd systeem kunt hEPCs om te herkennen van dysfunctionele substraten en bevordert wond genezing12,13. De relatie tussen ECM en hEPCs is echter duidelijk niet begrepen.
Hoewel veel onderzoekers geprobeerd te verduidelijken van de relatie tussen cel reacties en fysieke signalen van verschillende substraten14,15,16, deze studies gebruikt alleen de vaste grootte van een nanostructuur of nanopatterns met onregelmatige regelingen die een beperking tot verheldering van de relatie tussen de grootte van de cel en nanostructuur gedrag hebben. Het probleem hier is een gebrek aan geschikte instrumenten voor het screenen van cellulaire reacties die bestaande vervelend en iteratieve benaderingen om te zoeken naar de optimale omvang van de nanostructuur kunnen vervangen. Daarom is een eenvoudige techniek is vereist voor het screenen van cel reacties op fysieke stimulaties zonder herhaling.
Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt in onze vorige verslagen17,18,19 te produceren een kleurovergang nanopattern waarin de diameter van de gearrangeerde nanopillars geleidelijk verhoogt. Bovendien, beschreven we ook hoe te cultiveren en analyseren het gedrag van hECFCs op kleurovergang nanopattern platen om te bepalen van het effect van fysieke stimuli op de cellen. Een milde anodisatie, geleidelijke etsen en anti-steken laag coating methode werden gebruikt om het fabriceren van kleurovergang AAO schimmel. Door het aannemen van een thermisch inprenting lithografie techniek, werden identiek polystyreen verlopende nanopatterns geproduceerd op een kosteneffectieve en facile manier. Kleurovergang nanopatterns gebruikt, is het mogelijk om te bepalen welke grootte van nanostructuur heeft een groot effect op het gedrag van de cel in een set van experiment. Wij verwachten dat dit verloop nanopattern zal nuttig zijn bij het begrijpen van de mechanismen van de interactie tussen bloed-afgeleide hECFC of andere cellen en verschillende maten van nanostructuren.
Fabricage van een AAO vaak lijdt aan gebreken zoals scheuren, onregelmatige vormen van poriën, en branden. De belangrijkste reden voor deze gebreken heet een elektrolytische verdeling, die sterk wordt beïnvloed door de aard van de metalen substraten worden geanodiseerd en de soortelijke weerstand van de elektrolyt21. Aangezien de soortelijke weerstand van de elektrolyt hangt af van de temperatuur, is elimineren hitte voortdurend van elektroden het kritieke punt de locatiespecifieke om temperatuu…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs, wetenschap en technologie (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] en Bio & medische technologie-ontwikkeling Programma van de NRF gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT & toekomst Planning [NRF-2017M3A9C6029563].
Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
Mounting medium | DAKO | S3023 | |
Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |