Method Article

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

DOI:

10.3791/57661

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July 1st, 2018

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1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital

In This Article

Summary

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Aqui, apresentamos um protocolo para a fabricação de placas de gradiente nanopattern através de nanoimprinting térmica e o método de triagem respostas de células progenitoras endoteliais humanas para as nanoestruturas. Usando a tecnologia descrita, é possível produzir um andaime que pode manipular o comportamento de célula por estímulos físicos.

Abstract

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Nanotopography pode ser encontrado em várias matrizes extracelulares (ECMs) em torno do corpo e é conhecido por ter importantes acções regulamentares sobre reações celulares. No entanto, é difícil determinar a relação entre o tamanho de um nanostructure e as respostas das células devido à falta de ferramentas de triagem adequada. Aqui, nós mostramos o desenvolvimento de placas de nanopattern gradiente reprodutível e de baixo custo para a manipulação de respostas celulares. Usando o óxido de alumínio anódico (AAO) como um molde mestre, placas de gradiente nanopattern com nanopillars de intervalos de diâmetro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] foram fabricados por uma térmica impressão técnica. Estas placas de gradiente nanopattern foram projetadas para imitar os vários tamanhos de nanotopography em ECM e foram usadas para a tela de respostas do humanas formadoras células endoteliais (hECFCs). Neste protocolo, descrevemos o procedimento passo a passo de fabricação de placas de gradiente nanopattern para celular, técnicas de cultivo hECFCs de sangue periférico humano e cultivo hECFCs em placas de nanopattern de engenharia.

Introduction

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Recentemente, a resposta das células por estimulação física de topografia da superfície tem sido em destaque no campo da célula engenharia1,2,3,4. Portanto, mais atenção tem sido focada em nanoestruturas tridimensionais no celular acessório superfície5. Tem sido relatado que a integrina, que é o dispositivo de reconhecimento de superfície da célula, transmite o estímulo físico conduzido pelas estruturas micro-nano de ECM a transdução mechano6. Esta estimulação mecânica regula o comportamento da....

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Protocol

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Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional Hospital Coreia universitário Anam (IRB no. ED170495). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a declaração de Helsinki e suas alterações posteriores.

1. preparação do substrato de alumínio (Al) por polimento electrolítico

Atenção: Solução de polimento electrolítico é corrosivo e tóxico. Use equipamento de proteção pessoal, incluindo luvas de nitrila, óculos e jaleco. Execute esta etapa em uma coifa.

  1. Preparar a solução de polimento electrolítico através da mistura de etil álcool (C2H5

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Results

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A Figura 1 mostra SEM imagens dos moldes AAO gradientes fabricados de acordo com seu tipo e posição. A Figura 2 mostra SEM imagens das placas de gradiente nanopattern com nanopillars regular-arredondado, e a Figura 3 é dados de quantificação do diâmetro nanopillar. A tabela 1 lista as características da nanopillars fabricados.

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Discussion

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Fabricação de um AAO frequentemente sofre de defeitos tais como fissuras, formas irregulares de poros e queimando. A principal razão para esses defeitos é chamada uma repartição eletrolítica, que é fortemente afetada pela natureza das substratos metálicos sendo anodizado e a resistividade do eletrólito21. Desde que a resistividade do eletrólito varia de acordo com sua temperatura, eliminar o calor continuamente de eletrodos é o ponto crítico para manter a temperatura locacionais do eletrólito como.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação, ciência e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & desenvolvimento de tecnologia médica Programa da NRF financiado pelo Ministério da ciência, TIC & futuro planejamento [NRF-2017M3A9C6029563].

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ácido perclórico 60%Daejung Chemicals & Metais6512-4100
Álcool etílico, absoluto 99,9%Daejung Chemicals & Metais4118-4100
Ácido fosfórico 85%Daejung Chemicals & Metais6532-4400
Álcool metílico 99,5%Daejung Produtos químicos & Metais5558-4400
Óxido de cromo (VI)Daejung Chemicals & Metais2558-4400
Ácido sulfúrico 95%Daejung Chemicals & Metais7781-4100
Peróxido de hidrogênio 30%Daejung Chemicals & Metais4104-4400
n-hexano 95%Daejung Chemicals & Metais4081-4400
Tolueno 99,5%Daejung Produtos Químicos & Metais8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecil) dimetilclorosilanoGelestSIH5840.4Umidade sensível
Methoxynonafluorobutane 99%Sigma aldrich464309
Solução de colágenoStemcell#4902
GelatinaSigma aldrichG1890Solução
de revestimento de proteínaFicoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Solução de polissacarídeo hidrofílico
EGM-2MVLonzaCC-3202Meio de expansão de células endoteliais
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Solução salina tamponada com fosfatoGibco10010031
Soro bovino fetalGibco12483-020
ParaformaldeídoSigma aldrichP6148
GlutaraldeídoSigma aldrichG5882-100ML
Tetróxido de ósmioSigma aldrich201030-1G
HexametildisilazaneSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLOctilfenol etoxilato 
Soro de cabraGibco26050-088
anticorpo primário anti-vinculina humana Sonda F-actin Sigmaaldrich V9131
Sondas MolecularesA12379Faloidina conjugada com fluorescência
Alexa Fluor 488-conjugada anti-mouse  Anticorpo IgGMolecular ProbesA11001Anticorpo secundário conjugado com fluorescência 
4',6-diamidino-2-fenilindol Sigma aldrichD9542
Meio de montagemDAKOS3023
Anticorpo primário anti-vWF humano DAKOA0082
Anti-humano  Anticorpo primário CD144BD Biosciences#555661
Eponate 12™ Kit de incorporação, com BDMATed Pella18012Resina epóxi
Acetato de uranila, 25gTed Pella19481
Citrato de chumbo, trihidratado, 10gTed Pella19312
Placa de alumínio ultra puroGoodfellow26050-088
Folha de poliestirenoGoodfellowST313120
8.0" wafer de silícioSiltron29-01024-03Lado único polido, 725 µ m de espessura
Dessecador a vácuo, 4,4 LKartellKA.230
Bomba de vácuoVacuumerV3. VOP100
Fonte de alimentaçãoUnicorntechUDP-3003
Agitador magnéticoDaihan scientificSL.
Agitador suspensoDaihan scientificHT120DX
CirculadorDaihan scientificWCR-P12
Mesa de mudança linearZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Suporte angular, 90 grausZaberAB90MAcessório da pinça PMP de platina móvel linear
, 145 mmVitlab67995Pinça não metálica
Béquer PTFE, 250 mLCowieCW007.25
Limpador ultrassônicoBransonB2510MTH
cortador de PCBHozan Tool IndustrialK-110
Dispositivo de nanoimpressãoNanonexNX-2000
Gerador de plasma de oxigênioFemto ScienceCUTE
Esterilizador de baixa temperaturalowtem50
CO2PanasonicMCO-18AC
Microscópio de varredura a laser ConfoalCarl ZeissLSM700
Microscópio eletrônico de varreduraJEOLJSM6701
Microscópio eletrônico de transmissãoHitachiH-7500
SMS03022 Incubadora de cristal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.

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Thermal NanoimprintingGradient NanopatternAnodic Aluminum OxideHuman Endothelial Colony forming CellsNanopillar FabricationCell Response ScreeningPore Widening TechniqueSelf assembled MonolayersPolystyrene SubstrateFilopodia Outgrowth

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