Aqui, apresentamos um protocolo para a fabricação de placas de gradiente nanopattern através de nanoimprinting térmica e o método de triagem respostas de células progenitoras endoteliais humanas para as nanoestruturas. Usando a tecnologia descrita, é possível produzir um andaime que pode manipular o comportamento de célula por estímulos físicos.
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Artigo de método
Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nanotopography pode ser encontrado em várias matrizes extracelulares (ECMs) em torno do corpo e é conhecido por ter importantes acções regulamentares sobre reações celulares. No entanto, é difícil determinar a relação entre o tamanho de um nanostructure e as respostas das células devido à falta de ferramentas de triagem adequada. Aqui, nós mostramos o desenvolvimento de placas de nanopattern gradiente reprodutível e de baixo custo para a manipulação de respostas celulares. Usando o óxido de alumínio anódico (AAO) como um molde mestre, placas de gradiente nanopattern com nanopillars de intervalos de diâmetro crescente [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) e 280-360 nm (GP 280/360)] foram fabricados por uma térmica impressão técnica. Estas placas de gradiente nanopattern foram projetadas para imitar os vários tamanhos de nanotopography em ECM e foram usadas para a tela de respostas do humanas formadoras células endoteliais (hECFCs). Neste protocolo, descrevemos o procedimento passo a passo de fabricação de placas de gradiente nanopattern para celular, técnicas de cultivo hECFCs de sangue periférico humano e cultivo hECFCs em placas de nanopattern de engenharia.
Introdução
Recentemente, a resposta das células por estimulação física de topografia da superfície tem sido em destaque no campo da célula engenharia1,2,3,4. Portanto, mais atenção tem sido focada em nanoestruturas tridimensionais no celular acessório superfície5. Tem sido relatado que a integrina, que é o dispositivo de reconhecimento de superfície da célula, transmite o estímulo físico conduzido pelas estruturas micro-nano de ECM a transdução mechano6. Esta estimulação mecânica regula o comportamento da....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional Hospital Coreia universitário Anam (IRB no. ED170495). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a declaração de Helsinki e suas alterações posteriores.
1. preparação do substrato de alumínio (Al) por polimento electrolítico
Atenção: Solução de polimento electrolítico é corrosivo e tóxico. Use equipamento de proteção pessoal, incluindo luvas de nitrila, óculos e jaleco. Execute esta etapa em uma coifa.
- Preparar a solução de polimento electrolítico através da mistura de etil álcool (C2H5
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Resultados
A Figura 1 mostra SEM imagens dos moldes AAO gradientes fabricados de acordo com seu tipo e posição. A Figura 2 mostra SEM imagens das placas de gradiente nanopattern com nanopillars regular-arredondado, e a Figura 3 é dados de quantificação do diâmetro nanopillar. A tabela 1 lista as características da nanopillars fabricados.
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Discussão
Fabricação de um AAO frequentemente sofre de defeitos tais como fissuras, formas irregulares de poros e queimando. A principal razão para esses defeitos é chamada uma repartição eletrolítica, que é fortemente afetada pela natureza das substratos metálicos sendo anodizado e a resistividade do eletrólito21. Desde que a resistividade do eletrólito varia de acordo com sua temperatura, eliminar o calor continuamente de eletrodos é o ponto crítico para manter a temperatura locacionais do eletrólito como.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação, ciência e tecnologia (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] e Bio & desenvolvimento de tecnologia médica Programa da NRF financiado pelo Ministério da ciência, TIC & futuro planejamento [NRF-2017M3A9C6029563].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido perclórico 60% | Daejung Chemicals & Metais | 6512-4100 | |
| Álcool etílico, absoluto 99,9% | Daejung Chemicals & Metais | 4118-4100 | |
| Ácido fosfórico 85% | Daejung Chemicals & Metais | 6532-4400 | |
| Álcool metílico 99,5% | Daejung Produtos químicos & Metais | 5558-4400 | |
| Óxido de cromo (VI) | Daejung Chemicals & Metais | 2558-4400 | |
| Ácido sulfúrico 95% | Daejung Chemicals & Metais | 7781-4100 | |
| Peróxido de hidrogênio 30% | Daejung Chemicals & Metais | 4104-4400 | |
| n-hexano 95% | Daejung Chemicals & Metais | 4081-4400 | |
| Tolueno 99,5% | Daejung Produtos Químicos & Metais | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecil) dimetilclorosilano | Gelest | SIH5840.4 | Umidade sensível |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Solução de colágeno | Stemcell | #4902 | |
| Gelatina | Sigma aldrich | G1890 | Solução |
| de revestimento de proteínaFicoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Solução de polissacarídeo hidrofílico |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Meio de expansão de células endoteliais |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato | Gibco | 10010031 | |
| Soro bovino fetal | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldeído | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldeído | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Tetróxido de ósmio | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexametildisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octilfenol etoxilato |
| Soro de cabra | Gibco | 26050-088 | |
| anticorpo primário anti-vinculina humana | Sonda F-actin Sigma | aldrich V9131 | |
| Sondas Moleculares | A12379 | Faloidina conjugada com fluorescência | |
| Alexa Fluor 488-conjugada anti-mouse Anticorpo IgG | Molecular Probes | A11001 | Anticorpo secundário conjugado com fluorescência |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol | Sigma aldrich | D9542 | |
| Meio de montagem | DAKO | S3023 | |
| Anticorpo primário anti-vWF humano | DAKO | A0082 | |
| Anti-humano Anticorpo primário CD144 | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Kit de incorporação, com BDMA | Ted Pella | 18012 | Resina epóxi |
| Acetato de uranila, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Citrato de chumbo, trihidratado, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Placa de alumínio ultra puro | Goodfellow | 26050-088 | |
| Folha de poliestireno | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" wafer de silício | Siltron | 29-01024-03 | Lado único polido, 725 µ m de espessura |
| Dessecador a vácuo, 4,4 L | Kartell | KA.230 | |
| Bomba de vácuo | Vacuumer | V3. VOP100 | |
| Fonte de alimentação | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Agitador magnético | Daihan scientific | SL. | |
| Agitador suspenso | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulador | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Mesa de mudança linear | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Suporte angular, 90 graus | Zaber | AB90M | Acessório da pinça PMP de platina móvel linear |
| , 145 mm | Vitlab | 67995 | Pinça não metálica |
| Béquer PTFE, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Limpador ultrassônico | Branson | B2510MTH | |
| cortador de PCB | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Dispositivo de nanoimpressão | Nanonex | NX-2000 | |
| Gerador de plasma de oxigênio | Femto Science | CUTE | |
| Esterilizador de baixa temperatura | lowtem | 50 | |
| CO2 | Panasonic | MCO-18AC | |
| Microscópio de varredura a laser Confoal | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Microscópio eletrônico de varredura | JEOL | JSM6701 | |
| Microscópio eletrônico de transmissão | Hitachi | H-7500 |
Referências
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.
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Reimpressões e permissões
