Tillverkning av Gradient Nanopattern av termiska Nanoimprinting teknik och Screening i svaret av den humana endotelceller som kolonibildande
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för tillverkning av gradient nanopattern plattor via termisk nanoimprinting och metoden för screening Svaren av mänskliga endothelial stamceller till nanostrukturerna. Med den beskrivna tekniken, är det möjligt att producera en byggnadsställning som kan manipulera cell beteende av fysikaliska stimuli.
Abstract
Nanotopography kan hittas i olika extracellulära matriser (ECMs) runt kroppen och är kända för att ha viktiga lagstiftningsåtgärder på cellulära reaktioner. Det är dock svårt att bestämma förhållandet mellan storleken på en nanostruktur och svaren från celler på grund av bristen på lämplig screening verktyg. Här visar vi utvecklingen av reproducerbara och kostnadseffektiva gradient nanopattern plattor för manipulering av cellulära svar. Med anodisk aluminiumoxid (AAO) som en herre mögel, gradient nanopattern plattor med nanopillars ökande diameter varierar [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) och 280-360 nm (GP 280/360)] var fabricerade av en termisk imprinting teknik. Dessa gradient nanopattern pläterar var utformade för att efterlikna olika storlekar av nanotopography i ECM och användes till skärmen svaren från mänskliga kolonibildande endotelceller (hECFCs). I detta protokoll beskriver vi det stegvisa tillvägagångssättet av fabricera gradient nanopattern plattor för cell ingenjörsvetenskap, tekniker för odla hECFCs från perifert blod och odling hECFCs på nanopattern plåtar.
Introduction
Svaret från celler av fysisk stimulering av ytans topografi har nyligen varit fokuserade i fältet cell engineering1,2,3,4. Mer uppmärksamhet har därför fokuserat på tredimensionella nanostrukturer på cell fastsättning yta5. Det har rapporterats att integrin, som enhetens yta erkännande av cellen, överför den fysiska stimulans som drivs av mikro-nano strukturer ECM genom mechano-transduktion6. Denna mekanisk stimulering reglerar cell beteende genom kontakt vägledning7 och inducerar cytoskeletal omorganisation att ändra form, förutom fokal sammanväxningar och stelhet i celler8.
Mänskliga endothelial stamceller (hEPCs) i kroppen interagera noga med närmiljön av omgivande ECM9. Detta indikerar att det fysiska tillståndet av ECM fungerar som en viktig parameter för särskilda cell-matrix vidhäftning komplexa bildande som skjuvspänning som härrör från blod flöde10. Det rapporteras att surface nanotopography förstärker i vitro bildandet av omfattande kapillärrör nät av hEPCs11 och att en ECM/bio lösliga faktor kombinerat system gör det möjligt för hEPCs att erkänna dysfunktionella substrat och främjar Wound healing12,13. Förhållandet mellan ECM och hEPCs är dock inte klart förstått.
Även om många forskare försökte klargöra förhållandet mellan cell svaren och fysiska signaler från olika substrat14,15,16, dessa studier används endast en nanostruktur fast storlek eller nanopatterns med oregelbundna arrangemang som har en begränsning att klarlägga förhållandet mellan storleken på beteendet nanostruktur och cell. Problemet här är brist på lämpliga verktyg för screening cellulära svar som kan ersätta befintlig långtråkig och iterativa metoder för att hitta den optimala storleken av nanostrukturen. Därför krävs en enkel teknik för screening cell reaktioner på fysisk stimuli utan upprepning.
Här beskriver vi en metod som används i våra tidigare rapporter17,18,19 för att producera en gradient nanopattern där diametern på den ordnade nanopillars gradvis ökar. Dessutom beskrev vi också hur man odlar och analysera beteendet hos hECFCs på lutning nanopattern tallrikar att avgöra effekten av fysisk stimuli på cellerna. En mild anodisering, gradvis etsning och anti klibba lager beläggning metod användes för att fabricera gradient AAO mögel. Genom att anta en termisk imprinting litografi teknik, producerades identiska polystyren gradient nanopatterns i ett kostnadseffektivt och lättköpt sätt. Med hjälp av gradient nanopatterns, är det möjligt att avgöra vilken storlek av nanostruktur har en stor effekt på cellen beteende i en uppsättning av experiment. Vi förväntar oss att denna gradient nanopattern kommer att vara till hjälp för att förstå mekanismerna för interaktion mellan blod-derived hECFC eller andra celler och olika storlekar av nanostrukturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillverkning av en AAO ofta lider av defekter såsom sprickor, oregelbundna former av porer, och bränning. Den främsta orsaken till dessa defekter kallas en elektrolytisk fördelning, som påverkas starkt av de metall substrat att vara eloxerad karaktär och resistivitet av elektrolyt21. Eftersom resistivitet av elektrolyten varierar beroende på dess temperatur, är eliminera värme kontinuerligt från elektroder den kritiska punkten att hålla platsindikerande temperaturen av elektrolyten som …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av grundläggande vetenskap forskningsprogrammet genom den nationella forskning stiftelsen av Korea (NRF) finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] och Bio & medicinsk teknikutveckling Program för det nya regelverket finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT & framtida planering [NRF-2017M3A9C6029563].
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
Referências
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
- Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
- Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101 (2017).
- Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
- Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
- Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
- Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
- Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
- Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
- Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
- Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
- Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394 (2012).
- Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
- Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
- Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632 (2017).
- Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
- Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
- Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
- Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466 (1995).
- Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126 (1996).
- Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
- Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
- Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).
