종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과
Summary
종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.
Abstract
종속 키 1 (Cdk1)는 모든 진핵생물의 세포 주기 위한 마스터 컨트롤러와 프로테옴;의 약된 8-13% phosphorylates 그러나, Cdk1, 특히 인간의 세포에에서 대 한 확인된 대상 수 여전히 낮습니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 중요 하다, 그들은 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법에 대 한 기계적 통찰력을 제공. 세포 주기 규칙 충실 한 염색체 분리에 대 한 중요 하 고이 복잡 한 과정에 결함 염색체 착오 및 암으로 이어질.
여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치를 식별 하는 데 사용 되는 설명 합니다. 이 분석 결과, 순화 된 단백질은 phosphorylated 생체 외에서 상용 인간 Cdk1/ B. 성공에 의해 인 산화 SDS 페이지에서 확인 및 인 산화 사이트 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. 우리는 또한 정화 프로토콜 간의 상호 작용을 조사 확인 된 인 산화 위치의 기능 검증에 대 한 키 니 아 제 분석 실험 및 바인딩 분석 결과 대 한 적합 한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 항복을 설명합니다 클래식 핵 지 방화 신호 (cNLS) 그리고 그것의 핵 수송 수용 체 karyopherin α. 실험 설계와 투입, 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 접근 방법을 검토 합니다. 함께 이러한 프로토콜 Cdk1 전용 인 산화 사이트를 생성 하 고 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구는 매우 강력한 접근 방식을 제공 합니다. 때문에이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 그것은 적용할 수 있습니다 어떤 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에, 세포 기능 연구와 결합 하는 경우에 특히.
Introduction
Kinases는 기판에 ATP에서 인산 염 그룹을 전송 하 고 많은 세포질 과정을 조절 하는 효소. 이 인 산화 되돌릴 수, 빠르고, 두 부정적인 요금을 추가 및 저장 자유 에너지, 하 고 셀에서 사용 하는 가장 일반적인 posttranslational 수정 중 하나입니다. Cdk1, 일컬어 세포 주기 단백질 2 체 (cdc2)는 모든 진핵생물1,2,3,,45, 세포 주기 위해 마스터 컨트롤러가 고 phosphorylates는 프로테옴6,7의 예상된 8-13%.
최근 proteomic 연구는 단백질, 대부분의 경우에서에 많은 인 산화 사이트를 확인 하는 동안 키 이러한 수정에 대 한 책임을 알 수 있다. 인간 세포에서 특히 알려진된 Cdk1 목표의 수는 낮은7. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 설정 하는 기계 론 적인 연구를 하면 그것은 중요 하다. 세포 주기 규칙은 충실 한 염색체 분리 및 세포 분열에 대 한 중요 한 그리고 세포질 과정의 무수 한이 중요 한 생리 기능을 지원 하기 위해 발생 해야 합니다. 전사와 유사 분열, 세포의 구조와 핵, 염색체 응축, mitotic 스핀 들 어셈블리의 분해 등의 조직에 극적인 개편의 발병 이전 번역 중단 포함 됩니다. 규제 완화와 이러한 프로세스에서 오류가 발생할 암, 출생 결함, 또는 mitotic 세포 죽음. RO-3306 같은 Cdk1의 특정 억제제 개발된8, 기능성 연구를 위한 강력한 도구를 제공 하는 되었고 이러한 억제제 중 일부는 현재 암 치료에 대 한 임상 시험 (검토를 위해9 참조).
여기, 우리가 시험관에서 키 분석 결과 Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별 수 있도록 설명 합니다. 이 분석 결과에서 상용 인간 Cdk1/ B는 순화 대상 단백질에서 생체 외에서phosphorylate 데 사용 됩니다. 기판의 인 산화의 질량을 증가 하 고 추가 두 음 전; 따라서, 성공적인 인 산화는 SDS 페이지에 단백질 젤 밴드의 상승 교대에 의해 확인 된다. 인 산화 Cdk1 특정 사이트 이후 체 외에 phosphorylated 단백질의 질량 분석 분석에 의해 식별 됩니다. 실험적인 디자인으로 돕기 위해 우리는 또한 계산 도구와 단백질 시퀀스에서 Cdk1 관련 인 산화 위치의 예측에 대 한 참조를 검토 합니다. 또한, 우리는 또한 매우 순수 하 고 균질 단백질 준비 니 분석 결과 대 한 적합 한 생성 하는 정화 프로토콜 설명 합니다. 마지막으로, 기능 연구에 의해 확인 된 인 산화 사이트를 확인 해야 합니다 그리고 여기에 설명 된 간단한 바인딩 분석 결과 그 목적을 위해. 결합, 이것은 매우 강력한 접근 Cdk1 세포 주기7,,1011를 제어 하는 방법으로 기계 론 적인 연구를 가능 하 게 Cdk1 관련 인 산화 사이트를 생성. 이 메서드는 순화 된 단백질에 의존, 이후 모든 모델 유기 체 및 수율 신뢰할 수 있는 결과에 적용할 수 있습니다. 그러나, 취득된 인 산화 사이트에는 생체 외에서 의 기능 확인은 권장, 셀 추가 규제 메커니즘 posttranslational 수정, 상호 파트너 또는 셀룰러 지역화 같은 장소에는 인 산화 사이트 액세스할 수 또는 Cdk1에 의해 인식에 대 한 액세스할 수 없게 렌더링 수 있습니다.
Cdk1 어디 X 어떤 잔류물 이며 떠들고 또는 트레오닌 인 산화의 사이트 (Ser/Thr-프로-X-리스/Arg), 구성 된 합의 인 산화 사이트를 인식 합니다. 특히 중요 한 인식에 대 한 + 1 위치에 프롤린의 존재가입니다. + 2 또는 3 위치에 기본적인 잔류물을 선호 하는 또한, 대부분 Cdk1 관련 인 산화 사이트는 + 3에서 리스 또는 Arg를 포함 위치6,12.
Cdk1의 활성화 긴밀 하 게 규제 하 고 유사 분열1,2,3,,45의 발병에 연결 됩니다. 종속 kinases의 활동 일반적으로 진동 세포 주기13전역 수준에서 표현 되는 뚜렷한 cyclins ( A, B, C, D, 그리고 E 인간에서), 그들의 연관에 따라 달라 집니다. Cdk1는 일정 한 세포 주기 고 A와 B5,13,,1415로 규제 소 단위와의 연결에 의존 하는 그것의 활동의 규제 뿐만 아니라 포스트 번역 상 수정. Cdk1/ B 복합체의 형성이 키 니 아 제 활성화5,14,15,,1617,18에 대 한 필요 합니다. G2 단계 B는 cytosol에서 번역 및 그것은 Cdk15,14,15,16,,1718; 바인딩 핵을 가져올 그러나, Cdk1/ B 인간 Cdk1 억제 kinases Myt1에 의해 Thr14와 Tyr15 잔류물에 인 산화 (멤브레인 관련 티로신, 트레오닌-특정 cdc2 억제 키)와 Wee1, 각각19, 사 개최 20,21. 늦은 G2 단계에서 세포 분열 주기 25 인산 가수분해 효소 (cdc25)에 의해 Thr14와 Tyr15의 dephosphorylation Cdk1/ B 복합의 키 니 아 제 활동을 활성화 하 고 유사 분열12,14, 의 개시를 유발 18 , 20 , 22 , 23. Thr161 인 산화는 Cdk1/ B 활성화에도 필요 하 고 Cdk7, Cdk 활성화 키 (케이크)18에 의해 중재입니다. B anaphase에의 생긴다 Cdk1을, 유사 분열24,25에서 출구를 허용. Cdk1/ B의 활성화는 따라서 복잡 한 과정입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 상용 Cdk1/ b 수행 곤충 세포에서이 복합물의 재조합 식 동안 활성화 된 vivo에서 생 kinases14,20 이며 순화 된 상태에서 활성 상태로 유지 합니다. 결과 활성화, 재조합 인간 Cdk1/ B는 생체 외에서 키 니 아 제 분석 실험에 적합 합니다.
여기, 우리는 인간의 centromere 단백질 F (CENP F)10Cdk1 관련 인 산화 위치의 식별에 대 한 프로토콜을 설명합니다. CENP-F는 대부분 interphase (g 1과 S 상)의 중 핵에 있는 g 2 단계26,27,28 , Cdk1 종속 방식으로10에 cytosol에 수출 하는 kinetochore 단백질 11. 핵 지역화26이 분 cNLS 의해 수 여. cNLSs 핵 전송 요소 karyopherin α karyopherin β 및 RanGDP, 핵29에 cNLS 화물의 수입 촉진에 의해 인식 됩니다. G2 단계에서 핵 수출10알 수 없는 수출 통로 통해 촉진 된다. CENP-F는 cytosol에 있는, 일단 핵을 모집 하 고 차례 차례로 모터 단백질 복잡 한 다30,31신병. 이 통로 mitotic 항목의 정확한 타이밍에 대 한 및 두뇌에 있는 근본적인 과정에 대 한 중요 한 다 종속 방식 mitotic 스핀 들 어셈블리의 초기 단계는 centrosome 각각 핵 위치 하는 것이 중요 하다 개발30,,3132. G 2 단계에서 시작 해 서, CENP-F 또한 조립 되는 kinetochore에 충실 한 염색체 분리27,28,,3334,35에 대 한 중요 한 역할을가지고 . 이 통로의 주요 규제 단계는 Cdk110,11에 따라 g 2 단계에서 CENP-F의 핵 수출 이다. 여기 CENP F. cNLS에 Cdk1-관련 인 산화 위치의 식별 프로토콜 설명 이 사이트의 Phosphomimetic 돌연변이 CENP-f, B Cdk1/ 직접 CENP-F의 그것의 cNLS10의 인 산화에 의해 세포 지역화 조절 제안 핵 가져오기 천천히.
전반적으로,이 생체 외에서 니 분석 결과 수 있습니다 특정 기판의 식별을 키 Cdk1 정화 대상 단백질 phosphorylated 생체 외에서 상용 Cdk1/ B 복합물 및 인 산화 사이트에 대 한 이후 질량 분석에 의해 식별 됩니다. Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별 Cdk1 세포 주기를 제어 하는 방법을 계시 하는 기계 론 적인 연구를 지원 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 생체 외에서 니 분석 결과 세포 주기의 마스터 컨트롤러 및 많은 중요 한 세포질 과정을 조절 키 Cdk1를 위한 분자 표적을 식별 하는 매우 강력한 방법입니다. 메서드는 순화 된 단백질 Cdk1에 대 한 기판 이며 수 인 산화 특정 사이트의 경우 결정 합니다. 이 Cdk1 통해 인 산화에 의해 세포 프로세스의 규칙을 위한 기계 연구를 촉진 한다.
질량 분석에 의해 인 산화 위…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 질량 분석 분석 및 유용한 의견에 대 한 박사 데이비드 킹, 하 워드 휴즈 의학 연구소, 캘리포니아 대학 버클리를 감사합니다. 우리는 박사 Xuelian 주, 상하이, 생물 과학을 위한 학회, 과학의 중국 아카데미, 상하이, 중국 전체 길이 CENP F 구조를 제공 하기 위한 감사 합니다. 마지막으로, 우리는 감사 박사 수잔 베인 박사 브라이언 칼라, 빙 엄 턴 대학에서 박사 Christof Grewer 장비에 대 한 액세스. 이 연구는 뉴욕의 주립 대학 및 대학의 뉴욕 주립 빙햄 턴 화학과 연구 재단에 의해 투자 되었다.
Materials
| 2800 ml baffled Fernbach flask | Corning | 44232XL | |
| ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
| ATP | Fisher Scientfiic | BP413-25 | |
| benzamidine hydrochloride | Millipore Sigma | B6506-25 | |
| bottletop filter | Corning | 431161 | |
| Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | EMD Millipore | 14-450 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | Invitrogen | PV3292 | |
| Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer | New England Biolabs | P6020 | |
| CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid | Available upon request. | ||
| centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor | Thermo Scientific | 10033-778 | |
| centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes | EMD Millipore | UFC900324 | |
| chlorampenicol | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
| D/L methionine | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
| desalting pipet tips: Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
| disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm | Biorad | 7321010 | |
| dithiothreitol | Gold Biotechnology | DTT50 | |
| E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain | EMD Millipore | 71403 | |
| electrospray ionization Fourier transform ion | Bruker Amazon | Apex III | |
| cyclotron resonance mass spectrometer | |||
| electrospray ionization ion trap mass spectrometer | Bruker Amazon | custom | |
| fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
| FPLC system: Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
| Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| glutathione agarose | Pierce | 16101 | |
| glutathione, reduced | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| incubation shaker: multitron shaker | Infors | I10102 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| kanamycin | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| karyopherin α pet-28a pres plasmid | Available upon request. | ||
| Luria Bertani medium | Fisher Scientfiic | BP1426-2 | |
| microcentrifuge 5418R, refrigerated | Eppendorf | 5401000013 | |
| microtubes (0.5 ml) | Eppendorf | 30121023 | |
| microtubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
| Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
| pGEX-6P-1 plasmid | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Gold Biotechnology | P470-10 | |
| PS protease: PreScission protease | GE Healthcare | 27084301 | |
| Phos-tag acrylamide | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
| reduced gluthathione | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) | Fisher Scientfiic | 055291D | |
| site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
| Site-Directed Mutagenesis Kit | |||
| sonifier: Branson S-250D sonifier | Branson | 15 338 125 | |
| Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) | Spectrum Labs | 08 670B | |
| swing out rotor TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
Referências
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